Rilevazione diretta delle isolevuglandine nei tessuti utilizzando una proteina di fusione della fosfatasi alcalina D11 scFv e immunofluorescenza

Le isolevuglandine (IsoLGs) sono chetoaldeidi gamma altamente reattive formate da H2-isoprostani attraverso la perossidazione lipidica e le proteine reticolanti che portano all'infiammazione e a varie malattie tra cui l'ipertensione. Il rilevamento dell'accumulo di IsoLG nei tessuti è fondamentale per far luce sul loro coinvolgimento nei processi patologici. Tuttavia, la misurazione delle IsoLG nei tessuti è estremamente difficile e gli strumenti attualmente disponibili, compresa l'analisi della spettrometria di massa, sono laboriosi ed estremamente costosi. Qui descriviamo un nuovo metodo per la rilevazione in situ di IsoLGs nei tessuti utilizzando ScFv D11 coniugato con fosfatasi alcalina e un anticorpo fagico ricombinante prodotto in E. coli mediante microscopia immunofluorescente. Quattro controlli sono stati utilizzati per convalidare la colorazione: (1) colorazione con e senza D11, (2) colorazione con estratto periplasmatico batterico con il linker della fosfatasi alcalina, (3) colorazione anticorpale scFV irrilevante e (4) controllo competitivo con IsoLG prima della colorazione. Dimostriamo l'efficacia del D11 coniugato con fosfatasi alcalina in tessuti umani e murini con o senza ipertensione. Questo metodo servirà probabilmente come uno strumento importante per studiare il ruolo delle IsoLG in un'ampia varietà di processi patologici.