Digital-Droplet PCR om indels mutaties in genetisch gemodificeerde anopheline muggenpopulaties te detecteren

Recente ontwikkelingen in muggengennomica en genetische manipulatietechnologieën hebben de behoefte aan snelle en efficiënte methoden voor het detecteren van gerichte DNA-sequentievariatie op grote schaal bevorderd. Met name het detecteren van inserties en deleties (indels) op gen-bewerkte plaatsen gegenereerd door CRISPR-gids RNA (gRNA) / Cas9-gemedieerde niet-homologe eindverbinding (NHEJ) is belangrijk voor het beoordelen van de betrouwbaarheid van de mutagenese en de frequentie van onbedoelde veranderingen. We beschrijven hier een protocol voor digital-droplet PCR (ddPCR) dat zeer geschikt is voor nhej-analyse met hoge doorvoer. Hoewel deze methode geen gegevens produceert die individuele sequentievariatie identificeren, biedt het een kwantitatieve schatting van de sequentievariatie binnen een populatie. Bovendien kan dit protocol met de juiste middelen gemakkelijker worden geïmplementeerd in een laboratoriumomgeving op veldlocatie dan de volgende generatie of Sanger-sequencing. ddPCR heeft ook een snellere doorlooptijd voor resultaten dan een van deze methoden, wat een snellere en volledigere analyse van genetische variatie in wilde populaties mogelijk maakt tijdens veldproeven met genetisch gemanipuleerde organismen.