Digital-Droplet PCR för att upptäcka indelsmutationer i genetiskt modifierade anofenin myggpopulationer

De senaste framstegen inom mygggenomik och genteknik har främjat ett behov av snabba och effektiva metoder för att upptäcka riktad DNA-sekvensvariation i stor skala. Specifikt är det viktigt att upptäcka infogningar och borttagningar (indels) på genredigerade platser som genereras av CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-medierad icke-homolog end-joining (NHEJ) för att bedöma mutagenes trohet och frekvensen av oavsiktliga förändringar. Vi beskriver här ett protokoll för digital-droplet PCR (ddPCR) som är väl lämpad för NHEJ-analys med hög genomströmning. Även om den här metoden inte producerar data som identifierar individuell sekvensvariation, ger den en kvantitativ uppskattning av sekvensvariationen inom en population. Dessutom, med lämpliga resurser, kan detta protokoll implementeras i en fält-plats laboratorie inställning lättare än nästa generations eller Sanger sekvensering. ddPCR har också en snabbare vändningstid för resultat än någon av dessa metoder, vilket möjliggör en snabbare och mer fullständig analys av genetisk variation i vilda populationer under fältförsök av genetiskt modifierade organismer.