Visualisatie en kwantificering van TGFβ/BMP/SMAD-signalering onder verschillende vloeistofafschuifstressomstandigheden met behulp van proximity-ligation-assay

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signalering is strak gereguleerd en gebalanceerd tijdens de ontwikkeling en homeostase van het vasculatuursysteem Daarom resulteert deregulering in deze signaleringsroute in ernstige vasculaire pathologieën, zoals pulmonale arterie hypertensie, erfelijke hemorragische teleangiëctasie en atherosclerose. Endotheelcellen (EC's), als de binnenste laag van bloedvaten, worden voortdurend blootgesteld aan vloeistofschuifstress (SS). Van abnormale patronen van vloeibare SS is aangetoond dat ze de TGFβ / BMP-signalering verbeteren, die, samen met andere stimuli, atherogenese induceren. In verband hiermee bleek atheroprone, lage laminaire SS de TGFβ/BMP-signalering te verbeteren, terwijl atheroprotectieve, hoge laminaire SS deze signalering vermindert. Om de activering van deze paden efficiënt te analyseren, hebben we een workflow ontworpen om de vorming van transcriptiefactorcomplexen onder lage laminaire SS- en hoge laminaire SS-omstandigheden te onderzoeken met behulp van een in de handel verkrijgbaar pneumatisch pompsysteem en nabijheidsligatietest (PLA).

Actieve TGFβ/BMP-signalering vereist de vorming van trimerische SMAD-complexen bestaande uit twee regulerende SMADs (R-SMAD); SMAD2/3 en SMAD1/5/8 voor respectievelijk TGFβ- en BMP-signalering) met een gemeenschappelijke bemiddelaar SMAD (co-SMAD; SMAD4). Met behulp van PLA gericht op verschillende subeenheden van het trimerische SMAD-complex, d.w.z. R-SMAD / co-SMAD of R-SMAD / R-SMAD, kan de vorming van actieve SMAD-transcriptiefactorcomplexen kwantitatief en ruimtelijk worden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Het gebruik van stromingsdia's met 6 kleine parallelle kanalen, die in serie kunnen worden aangesloten, maakt het mogelijk om de transcriptiefactorcomplexvorming te onderzoeken en noodzakelijke controles op te nemen.

De hier uitgelegde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor studies die gericht zijn op de nabijheid van SMADs tot andere transcriptiefactoren of tot transcriptiefactorcomplexen anders dan SMADs, in verschillende vloeibare SS-omstandigheden. De hier gepresenteerde workflow toont een snelle en effectieve manier om de vloeistof SS geïnduceerde TGFβ / BMP-signalering in EC's te bestuderen, zowel kwantitatief als ruimtelijk.