מחקר זה נתמך על ידי מלגת העתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) (FT16010043) ותוכנית החוזים העתידיים של ANU.

1. התקנת כלים וחבילות R המשמשים בניתוח
<ol><li>קונדה הוא מנהל חבילות פופולרי וגמיש המאפשר התקנה נוחה של חבילות עם התלות שלהן בכל הפלטפורמות. השתמש ב- 'Anaconda' (מנהל חבילות conda) כדי להתקין 'conda' שניתן להשתמש בו כדי להתקין את הכלים / החבילות הדרושים לניתוח.</li>
	<li>הורד את 'Anaconda' בהתאם לדרישות המע...

<ol>
	<li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation.">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation.">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns.">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li><li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors.">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li><li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PolyASite+2.0:+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3'+end+sequencing.">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li><li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems.">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364 (2014).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data.">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2014).</li><li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rMATS:+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data.">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li><li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies.">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li><li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data.">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood.">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li><li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease.">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li><li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequence+read+archive.">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, 19-21 (2010).</li><li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GNU parallel-the command-line power tool. 36, 42-47 (2011).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data.">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25 (2010).</li><li>Veiga, D. F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=maser:+Mapping+Alternative+Splicing+Events+to+pRoteins.">maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins.</a> R package version 1.4.0. , (2019).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Ram&#237;rez, F., D&#252;ndar, F., Diehl, S., Gr&#252;ning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=deepTools:+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data.">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li><li>Merino, G. A., Conesa, A., Fern&#225;ndez, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies.">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li><li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection.">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13 (2016).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification.">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li></ol>

במחקר זה, הערכנו גישות מבוססות אקסון ומבוססות אירועים לזיהוי AS ו-APA בנתוני RNA-Seq בתפזורת ובנתוני ריצוף קצה של 3'. גישות ה-AS המבוססות על אקסון מייצרות הן רשימה של אקסונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי והן דירוג ברמת הגן המסודר לפי המובהקות הסטטיסטית של פעילות השחבור הדיפרנציאלית הכוללת ברמת הגן (...

RNA-seq היה בשימוש נרחב לאורך השנים בדרך כלל להערכת ביטוי גנים דיפרנציאליים וגילוי גנים1. בנוסף, ניתן להשתמש בו גם כדי להעריך שימוש משתנה ברמת אקסון עקב גנים המבטאים איזופורמים שונים, ובכך לתרום להבנה טובה יותר של ויסות גנים ברמה שלאחר השעתוק. רוב הגנים האאוקריוטים מייצרים איזופורמים שונים על ידי שחבור חלופי (AS) כדי להגדיל את המגוון של ביטוי mRNA. ניתן לחלק את אירועי AS לדפוסים שונים: דילוג על אקסונים שלמים (SE) שבהם אקסון ("קלטת") מוסר לחלוטין מהתמליל יחד עם האינטרונים האגפים שלו; בחירת אתר שחבור חלופי (תורם) 5' (A5SS) וחלופה 3' (מקבל) בחירת אתר שחבור (A3SS) כאשר שני אתרי שחבור או יותר נמצאים משני קצותיו של אקסון; שמירה של אינטרונים (RI) כאשר אינטרון נשמר בתוך תעתיק mRNA בוגר והדרה הדדית של שימוש באקסון (MXE) כאשר רק אחד משני האקסונים הזמינים יכול להישמר בכל פעם 2,3. פוליאדנילציה חלופית (APA) ממלאת גם תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים באמצעות אתרי פולי (A) חלופיים ליצירת איזופורמים מרובים של mRNA מתעתיק יחיד4. רוב אתרי הפוליאדנילציה (pAs) ממוקמים באזור 3' לא מתורגם (3' UTRs), ומייצרים איזופורמים של mRNA עם אורכי UTR מגוונים של 3'. מכיוון שה-UTR 3' הוא הרכזת המרכזית לזיהוי אלמנטים רגולטוריים, אורכי UTR שונים של 3' יכולים להשפיע על לוקליזציה, יציבות ותרגוםmRNA 5. ישנם סוגים של מבחני רצף קצה 3 'הממוטבים לזיהוי APA השונים בפרטי הפרוטוקול6. הצינור המתואר כאן מיועד ל- PolyA-seq, אך ניתן להתאים אותו לפרוטוקולים אחרים כמתואר.
במחקר זה אנו מציגים צינור של שיטות ניתוח אקסון דיפרנציאליות7,8 (איור 1), שניתן לחלק לשתי קטגוריות רחבות: מבוססות אקסון (DEXSeq9, diffSplice 10) ומבוססות אירועים (ניתוח רב-משתני משוכפל של שחבור תעתיק (rMATS)11). השיטות המבוססות על אקסון משוות את שינוי הקיפול על פני תנאים של אקסונים בודדים, כנגד מידה של שינוי קיפול גנים כולל כדי לקרוא לשימוש באקסון המתבטא באופן דיפרנציאלי, ומתוך כך מחשבים מדידה ברמת הגן של פעילות AS. שיטות מבוססות אירועים משתמשות בקריאות צומת exon-intron-spanning כדי לזהות ולסווג אירועי שחבור ספציפיים כגון דילוג אקסון או שמירה של אינטרונים, ולהבחין בין סוגי AS אלה בפלט3. לפיכך, שיטות אלה מספקות תצוגות משלימות לניתוח מלא של AS12,13. בחרנו ב- DEXSeq (בהתבסס על חבילת DESeq214 DGE) ו- diffSplice (בהתבסס על חבילת Limma10 DGE) למחקר מכיוון שהם בין החבילות הנפוצות ביותר לניתוח שחבור דיפרנציאלי. rMATS נבחרה כשיטה פופולרית לניתוח מבוסס אירועים. שיטה פופולרית נוספת המבוססת על אירועים היא MISO (תערובת של איזופורמים)1. עבור APA אנו מתאימים את הגישה מבוססת exon.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> איור 1. צינור ניתוח. תרשים זרימה של השלבים המשמשים בניתוח. השלבים כוללים: קבלת הנתונים, ביצוע בדיקות איכות ויישור קריאה ולאחר מכן ספירת קריאות באמצעות ביאורים עבור exons, introns ואתרי pA ידועים, סינון כדי להסיר ספירות נמוכות ונורמליזציה. נתוני PolyA-seq נותחו עבור אתרי pA חלופיים באמצעות שיטות diffSplice/DEXSeq, RNA-Seq בתפזורת נותח עבור שחבור חלופי ברמת האקסון בשיטות diffSplice/DEXseq, ואירועי AS נותחו עם rMATS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
נתוני ה-RNA-seq ששימשו בסקר זה נרכשו מביטוי גנים אומניבוס (GEO) (GSE138691)15. השתמשנו בנתוני RNA-seq של עכברים ממחקר זה עם שתי קבוצות מצב: נוקאאוט מסוג פראי (WT) ונוקאאוט דמוי שריר מסוג 1 (Mbnl1 KO) עם שלושה שכפולים כל אחד. כדי להדגים ניתוח שימוש באתר פוליאדנילציה דיפרנציאלית, השגנו נתוני פוליA-seq של עוברי עכברים (MEFs) (GEO Accession GSE60487)16. לנתונים יש ארבע קבוצות מצבים: סוג פראי (WT), דמוי שרירים מסוג 1/סוג 2 נוקאאוט כפול (Mbnl1/2 DKO), Mbnl 1/2 DKO עם נוקאאוט Mbnl3 (KD) ו- Mbnl1/2 DKO עם בקרת Mbnl3 (Ctrl). כל קבוצת תנאים מורכבת משני עותקים משוכפלים.
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>הצטרפות גיאוגרפית</td>
			<td>מספר הפעלה של SRA</td>
			<td>שם לדוגמה</td>
			<td>תנאי</td>
			<td>לשכפל</td>
			<td>טישו</td>
			<td>רצף</td>
			<td>אורך קריאה</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">רנ"א-סק</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>נוקאאוט Mbnl1</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>נוקאאוט Mbnl1</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>נוקאאוט Mbnl1</td>
			<td>חזרה 3</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>סוג פראי</td>
			<td>חזרה 3</td>
			<td>התימוס</td>
			<td>סוף מזווג</td>
			<td>100 כ"ס</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-Seq</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>סוג פראי (WT)</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>סוג פראי (WT)</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול (DKO)</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול (DKO)</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול עם Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול עם Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול עם siRNA ללא מיקוד (Ctrl)</td>
			<td>נציג 1</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 נוקאאוט כפול עם siRNA ללא מיקוד (Ctrl)</td>
			<td>חזרה 2</td>
			<td>פיברובלסטים עובריים לעכבר (MEFs)</td>
			<td>קצה יחיד</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1. סיכום של מערכי נתונים של RNA-Seq ו- PolyA-seq המשמשים לניתוח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Not relevent for computational study</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of alternative splicing and polyadenylation in rna-seq data

בנוסף לניתוח הטיפוסי של RNA-Seq למדידת ביטוי גנים דיפרנציאלי (DGE) בתנאים ניסיוניים/ביולוגיים, ניתן להשתמש בנתוני RNA-seq גם כדי לחקור מנגנוני ויסות מורכבים אחרים ברמת האקסון. שחבור חלופי ופוליאדנילציה ממלאים תפקיד מכריע במגוון התפקודי של גן על ידי יצירת איזופורמים שונים כדי לווסת את ביטוי הגנים ברמה שלאחר השעתוק, והגבלת הניתוחים לרמת הגן כולה עלולה לפספס את שכבת הוויסות החשובה הזו. כאן, אנו מדגימים ניתוחים מפורטים צעד אחר צעד לזיהוי והדמיה של שימוש באקסון דיפרנציאלי ובאתר פוליאדנילציה בתנאים שונים, תוך שימוש ב- Bioconductor ובחבילות ופונקציות אחרות, כולל DEXSeq, diffSplice מחבילת לימה ו- rMATS.

לאחר הפעלת זרימת העבודה שלב אחר שלב לעיל, פלטי הניתוח AS ו- APA והתוצאות המייצגות הם בצורה של טבלאות ומתווי נתונים, שנוצרו כדלקמן.
כפי: התפוקה העיקרית של ניתוח AS (טבלה משלימה 1 עבור diffSplice; טבלה 2 עבור DEXSeq) היא רשימה של אקסונים המציגים שימוש דיפרנציאלי ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data at JoVE.com

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

פרוטוקול זה מספק הבנה מקיפה של איזופורמים של גנים הנוצרים על ידי שחבור חלופי ופוליאדנילציה על ידי מתן זרימת עבודה שלב אחר שלב לזיהוי אתרי שחבור דיפרנציאליים, אקסונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי ואתרי פולי(A). היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מעריך הן שיטות מבוססות אקסון והן שיטות מבוססות אירועים לחקר שחבור חלופי. היא גם מיישמת שיטה מבוססת אקסון לחקר פוליאדנילציה חלופית.קבצי R Markdown הכוללים את הקודים וההערות עבור ניתוח AS ו- AP סופקו. מומלץ לבצע את השלבים בקובץ R Markdown ולהגיע להערה עבור כל שלב בזהירות. כדי לזהות שחבור דיפרנציאלי באמצעות diffSplice מלימה, עקוב אחר קובץ המחברת R.הכן את קבצי הקלט כמתואר בכתב היד של הטקסט. ודא ששלבים 1 עד 3 בכתב היד בוצעו ברצף כדי להכין קבצי קלט לפני שתמשיך הלאה. התחל על ידי טעינת הספריות הדרושות.כדי לבצע סינון לא ספציפי, תחילה חלץ את מטריצת ספירות הקריאה שהתקבלו בעבר וצור רשימה של תכונות באמצעות הפונקציה DGEList מחבילת edgeR, שבה שורות מייצגות גנים ועמודות מייצגות דגימות. לאחר מכן, הפוך את הנתונים מקנה מידה גולמי לספירה למיליון באמצעות הפונקציה CPM מחבילת edgeR, ושמור על אקסונים עם ספירות הגדולות מסף הניתן להגדרה. ערכת נתונים זו מכילה שש דוגמאות.לפיכך, ה-CPM נקבע על יותר מדגימה אחת ולפחות שלוש דגימות מתוך שש. נרמל את הספירות בין דגימות באמצעות הפונקציה calcNormFactors מחבילת edgeR באמצעות ממוצע חתוך של ערכי M. פונקציה זו תחשב גורמי קנה מידה כדי להתאים את גודל הספרייה.השתמש בטבלת הדוגמאות שנוצרה בעבר כדי ליצור את מטריצת העיצוב כדי להגדיר את תנאי הניסוי עבור כל דגימה. הפעל את פונקציית voom של חבילת לימה כדי לעבד נתוני ריצוף RNA כדי להעריך את השונות. פונקציה זו תיצור משקלים מדויקים לתיקון רעשי ספירת פואסון ותהפוך את ספירות רמת האקסון לרישום שתי ספירות למיליון או logCPM.הפעל את פונקציית lmfit כדי להתאים מודלים ליניאריים לנתוני הביטוי עבור כל אקסון. לאחר מכן הפעל את פונקציית eBayes כדי לחשב סטטיסטיקה מבוססת אמפירית עבור המודל המותאם כדי לזהות ביטוי אקסון דיפרנציאלי. הגדר מטריצת ניגודיות להשוואות הניסוייות המעניינות.השתמש בניגודים. פונקציית התאמה לקבלת מקדמים ושגיאות תקן עבור כל זוג השוואות. הפעל diffSplice על המודל המותאם כדי לבחון את ההבדלים בשימוש אקסון של גנים בין סוג פראי נוקאאוט.חקור את התוצאות המדורגות ביותר באמצעות פונקציית topSplice שבה בדיקה השווה ל- t נותנת דירוג של אקסונים של AS ובדיקה השווה לסימס נותנת דירוג של גנים. הפעל את הפונקציה plotSplice כדי להתוות את התוצאות. כאשר מכניסים את הגן המעניין לטיעון מזהה הגן, הנקודות האדומות מציגות את האקסונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי.צור חלקת הר געש באמצעות חבילת המוליכים הביולוגיים EnhancedVolcano כדי להציג את האקסונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. כדי להשתמש ב- rMATS, ודא שהגרסה העדכנית ביותר של rMATS גירסה 4.1.1 מותקנת באמצעות conda או GitHub בספריית העבודה. עבור אל התיקיה המכילה קבצי bam שהתקבלו לאחר המיפוי.הכן קבצי טקסט כנדרש על-ידי rMATS עבור שני התנאים של העתקת השם של קבצי bam והנתיב שלהם מופרדים על ידי פסיק. הפעל rmas. py באמצעות שני קבצי טקסט קלט שנוצרו המתארים את הנתיב של קבצי BAM ואת הביאור.קובץ GTF שהושג בעבר. פעולה זו יוצרת תיקיית פלט rmats_out המכילה קבצי טקסט המתארים נתונים סטטיסטיים הכוללים ערכי P ורמות הכללה עבור כל אירוע שחבור בנפרד. השתמש במזר חבילת המוליכים הביולוגיים כדי לחקור את תוצאות rMATS.טען את הצומת ואקסון סופר קבצי טקסט עם הסיומת JCEC לתוך אובייקט maser וכלול לפחות חמש קריאות ממוצעות לכל אירוע שחבור כדי לסנן את התוצאה בהתבסס על כיסוי. כדי להמחיש את תוצאות ה- rMATS, הפעל תחילה את הפונקציה topEvents מחבילת המזר, ובחר את אירועי השחבור המשמעותיים בשיעור גילוי כוזב של 10% ושינוי מינימלי של 10% באחוזים שחבורים ב- או PSI. בדוק את אירועי הגן עבור גנים בודדים בעלי עניין והתווה ערכי PSI עבור כל אירוע שחבור של אותו גן.צור תרשים הר געש על-ידי ציון סוג האירוע. השתמש בתוצאות אירועי השחבור המתקבלות עם rMATS בצורה של קבצי טקסט כדי ליצור עלילות סשימי באמצעות חבילת rmats2sashimiplot. עלילת הסשימי מציגה אירוע אקסון מדלג בגן Wnk1.כל שורה מייצגת דגימת RNA-seq, שלושה שכפולים מסוג פראי ונוקאאוט Mbnl1. הגובה מראה כיסוי קריאה ב- RPKM והקשתות המחברות מתארות קריאות צומת על פני אקסונים. החלק התחתון מציג איזופורמים חלופיים של מודל גנים מבואר.ניתן לראות שינוי משמעותי בקיפול וראיות סטטיסטיות חזקות להבדלים אמיתיים בגנים הממוקמים ברבעים השמאליים או הימניים העליונים של חלקות הר הגעש המתקבלות באמצעות diffSplice ו- DEXSeq. אקסון קסטה נמצא משתנה בין תנאים שונים עבור הגן Wnk1. חלקת השימוש באקסון דיפרנציאלי הראתה עדויות לשחבור דיפרנציאלי בחמישה אתרי אקסון ליד Wnk1.6.45, כאשר האקסונים המודגשים בוורוד עשויים להיות משודכים בדגימות נוקאאוט Mbnl1 בהשוואה לסוג פראי.חלקת הר הגעש של גנים שחבורים לחלופין סייעה להבחין בין הגנים שלא נכללו בסוג הבר לבין אלה שנכללו בסוג הבר. סוגי אירועי השחבור SE, A5SS, A3SS, MXE ו-RI הודגמו באמצעות חלקות סשימי של הגנים המשמעותיים ביותר של אותם אירועים. פעילות ה-APA הדיפרנציאלית בשלושה אזורים ראשוניים לא מתורגמים של גנים נצפתה באמצעות חלקות הר געש.תוצאות השימוש באתר הרשות הפלסטינית, בעלות ההפרש המשמעותי, שנרכשו מצינורות שונים, הוצגו באמצעות עלילת אירוע. ניתן לראות תזוזה דיסטלית משמעותית עד פרוקסימלית של השימוש באתר PA בנוקאאוטים כפולים בשני הגנים FOSL1 ו- Papola. הכיסוי הממוצע באזורי אגף המעוגנים באתרי ביקוע ידועים של הרשות הפלסטינית ברמה הגנומית כולה נקבע באמצעות חלקת אבחון.ודא שהפרמטרים כגון מידע טרנס-ספציפי ומאפשרים חפיפה מרובה משמשים כראוי בעת יצירת מדדי ספירה. התאמת מודל ליניארי ויצירת זוגות ניגודיות חשובים להשוואה נכונה. עבור rMATS, ודא שכל הפרמטרים מוגדרים כראוי בהתאם לנתונים שלך לפני הפעלת הפקודה.הגנים המתקבלים מפעילות שחבור דיפרנציאלית יכולים לשמש לביצוע ניתוח העשרת סט גנים. כלי נוסף בשם MISO יכול לשמש לניתוח נוסף מבוסס אירועים.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

Abstract