Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

Быстрые ответы, включающие быстрое перераспределение матричной(м)РНК и изменения трансляции мРНК, имеют отношение к текущим гомеостатическим корректировкам клеток. Эти корректировки имеют решающее значение для выживаемости эукариотических клеток и «контроля повреждений» во время колебаний уровня питательных веществ и солености, температуры и различных химических и радиационных стрессов. Из-за высокодинамического характера ответов на уровне РНК и нестабильности многих промежуточных продуктов РНК:РНК и РНК:белок получение значимого снимка состояния цитоплазматической РНК возможно только при ограниченном числе методов. Эксперименты по профилированию рибосом на основе транскриптома на основе РНК-seq являются одними из наиболее информативных источников данных для контроля трансляции. Однако отсутствие равномерной промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок может привести к различным смещениям, особенно в быстро меняющихся путях клеточного ответа. В этой статье мы предоставляем подробный протокол быстрой фиксации, применимый к эукариотическим клеткам различной проницаемости, чтобы помочь в промежуточной стабилизации РНК и РНК:белок. Далее приведены примеры выделения стабилизированных комплексов РНК:белок на основе их совместного осаждения с рибосомными и поли(рибо)сомальными фракциями. Отделенный стабилизированный материал может быть впоследствии использован в рамках экспериментов типа профилирования рибосом, таких как подход секвенирования трансляционного комплексного профиля (TCP-seq) и его производных. Универсальность методов в стиле TCP-seq в настоящее время продемонстрирована приложениями в различных организмах и типах клеток. Стабилизированные комплексы также могут быть дополнительно очищены сродством и визуализированы с помощью электронной микроскопии, разделены на различные поли(рибо)сомальные фракции и подвергнуты секвенированию РНК, благодаря легкости разворота сшивки. Поэтому методы, основанные на охлаждении и фиксации формальдегида с последующим осаждением или другим типом обогащения комплекса РНК:белок, могут представлять особый интерес для исследования более тонких деталей быстрой динамики комплекса РНК:белок в живых клетках.