وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81870432 81570567 إلى شركة X.L.Z. (رقم 81571994 إلى شركة P.N.S.)؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة غوانغدونغ، الصين (رقم 2020A1515010054 إلى P.N.S.)، مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.

1. صيانة الخلايا الجذعية
ملاحظة: بروتوكول صيانة الخلية الموضحة أدناه ينطبق على خط الخلية hES03 الاحتفاظ بها في أحادية تابعة. بالنسبة لجميع البروتوكولات التالية في هذه المخطوطة، يجب التعامل مع الخلايا تحت خزانة السلامة البيولوجية.
<ol><li>إعداد 1x mTesR الخلايا الجذعية ثقافة المتوس...

<ol>
	<li>Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Metabolism+in+the+Liver:+Nutritional+and+Physiological+Significance.">Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).</li><li>Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cellular+mechanisms+of+liver+dysfunction+in+COVID-19.">Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19.</a> Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).</li><li>Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressants-+and+antipsychotics-induced+hepatotoxicity.">Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+qualified+clinical-grade+functional+hepatocytes+from+human+embryonic+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Death &amp; Disease. 10, 763 (2019).</li><li>Rassouli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Patterns+of+Royan+Human+Embryonic+Stem+Cells+Correlate+with+Their+Propensity+and+Culture+Systems.">Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems.</a> Cell Journal. 21, 290-299 (2019).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+endoderm+induction+from+human+pluripotent+stem+cells+by+logically+directing+signals+controlling+lineage+bifurcations.">Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations.</a> Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).</li><li>Mukherjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox17+and+beta-catenin+co-occupy+Wnt-responsive+enhancers+to+govern+the+endoderm+gene+regulatory+network.">Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Ang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Roadmap+for+Human+Liver+Differentiation+from+Pluripotent+Stem+Cells.">A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).</li><li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+human+stem+cell-derived+hepatocytes+establish+an+infectious+HCV+murine+model.">Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model.</a> Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).</li><li>Gomez, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+induction+by+temporal+modulation+of+WNT+activation.">Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation.</a> Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).</li><li>Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Isthmic+Organizer-Like+Cells+from+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells.</a> Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+definitive+endoderm+subtypes+by+robust+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells.</a> Differentiation. 92, 281-290 (2016).</li><li>Mathapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule-Directed+Hepatocyte-Like+Cell+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).</li><li>Hay, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+differentiation+of+hESCs+to+functional+hepatic+endoderm+requires+ActivinA+and+Wnt3a+signaling.">Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).</li><li>Yu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K/mTORC2+regulates+TGF-beta/Activin+signalling+by+modulating+Smad2/3+activity+via+linker+phosphorylation.">PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation.</a> Nature Communications. 6, 7212 (2015).</li><li>Borowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).</li><li>Tahamtani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+human+embryonic+stem+cells+with+different+combinations+of+priming+and+inducing+factors+toward+definitive+endoderm.">Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm.</a> Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).</li><li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+hepatocyte-like+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).</li><li>Sullivan, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+human+hepatic+endoderm+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells.</a> Hepatology. 51, 329-335 (2010).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cell-derived+hepatocytes+as+a+model+for+hepatitis+B+virus+infection,+spreading+and+virus-host+interactions.">Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions.</a> Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+applications+of+human+hepatocyte-like+cells.">Derivation and applications of human hepatocyte-like cells.</a> World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).</li><li>Ogawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+and+cAMP+signaling+promote+the+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+hepatocytes.">Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes.</a> Development. 140, 3285-3296 (2013).</li><li>Kim, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+drug-induced+immune-mediated+hepatotoxicity+using+hepatocyte-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells.</a> Toxicology. 387, 1-9 (2017).</li></ol>

هنا، نقدم طريقة تدريجية تحفز HLCs من hESCs على ثلاث مراحل. وفي المرحلة الأولى، استخدمت أكتيفين ألف وCHIR99021 لتمييز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى DE. وفي المرحلة الثانية، استخدمت الخلايا السلفية KO-DMEM وDMSO لتمييز DE إلى خلايا سلف كبدية. وفي المرحلة الثالثة، استخدمت HZM بالإضافة إلى HGF وOSM وهيدروكورت...

الكبد هو جهاز الأيضية للغاية التي تلعب عدة أدوار, بما في ذلك السمية, تخزين الجليكوجين, وإفراز وتوليف البروتينات1. مسببات الأمراض المختلفة والأدوية والوراثة يمكن أن يسبب تغيرات مرضية في الكبد وتؤثر على وظائفه2،3. تلعب خلايا الكبد ، باعتبارها الوحدة الوظيفية الرئيسية للكبد ، دورا مهما في أنظمة دعم الكبد الاصطناعي والقضاء على سمية الدواء. ومع ذلك ، فإن مورد خلايا الكبد البشرية الأولية محدود في العلاج القائم على الخلايا ، وكذلك في أبحاث أمراض الكبد. لذلك ، فإن تطوير مصادر جديدة للخلايا الكبدية البشرية الوظيفية هو اتجاه بحثي مهم في مجال الطب التجديدي. منذ عام 1998 عندما تم إنشاء hESCs4، وقد تم النظر على نطاق واسع hESCs من قبل الباحثين بسبب إمكاناتها التمايز متفوقة (أنها يمكن أن تفرق في أنسجة مختلفة في بيئة مناسبة) ودرجة عالية من التجديد الذاتي، وبالتالي توفير خلايا المصدر المثالي للكبد الاصطناعي الحيوي، وزرع خلايا الكبد وحتىهندسة أنسجةالكبد 5 .
حاليا، يمكن زيادة كفاءة التمايز الكبدي بشكل كبير من خلال إثراء اندوديرم6. في تمايز النسب من الخلايا الجذعية إلى بطانة الرحم، ومستويات عامل النمو تحويل β (TGF-β) الإشارات ومسارات الإشارات WNT هي العوامل الرئيسية في عقدة مرحلة تشكيل بطانة الرحم. تفعيل مستوى عال من TGF-β وWNT الإشارات يمكن أن تعزز تطوير endoderm7,8. أكتيفين A هو السيتوكين تنتمي إلى عائلة فائقة TGF-β. لذلك ، يستخدم Activin A على نطاق واسع في تحريض الإندوديرم للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) وhESCs9،10. GSK3 هو بروتين سيرين ثريونين كيناز. وقد وجد الباحثون أن CHIR99021، مثبط محدد من GSK3β، يمكن أن تحفز إشارات WNT نموذجية، ويمكن أن تعزز تمايز الخلايا الجذعية في ظل ظروف معينة، مما يشير إلى أن CHIR99021 لديه القدرة على تحفيز تمايز الخلايا الجذعية في endoderm 11،12،13.
هنا نبلغ عن طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز التمايز الفعال للمركبات الهيدروفلورية إلى مركبات إتش إل سي وظيفية. أنتجت الإضافة المتتابعة ل Activin A و CHIR99021 حوالي 89.7±0.8٪ SOX17 (DE marker) خلايا إيجابية. بعد أن نضجت هذه الخلايا في المختبر، عبرت عن علامات محددة كبدية ومارست مورفولوجيا تشبه الخلايا الكبدية (استنادا إلى تلطيخ الهيماتوكسيلين -إيوزين (H و E)) ووظائف ، مثل امتصاص الأخضر الإندوسيانين (ICG) وتخزين الجليكوجين ونشاط CYP3. وتبين النتائج أن hESCs يمكن تمييزها بنجاح إلى HLCs وظيفية ناضجة بهذه الطريقة ويمكن أن توفر أساسا للبحوث المتعلقة بأمراض الكبد وفحص الأدوية في المختبر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0512</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 labeled goat against Rabbit IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZF-0516</td>
			<td>For IF,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>For cell passage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>120-14E</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Albumin (ALB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6684</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - Human Oct4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab19587</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti - &#945;-Fetoprotein (AFP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8452</td>
			<td>For IF and WB, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -SOX17</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab224637</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4&#945;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1412164</td>
			<td>For IF, primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST023-200g</td>
			<td>For cell blocking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1046</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-water</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0021</td>
			<td>For RNA dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM3189</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-12071</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E staining kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0105S</td>
			<td>For H&#38;E staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepatocyte growth factor (HGF)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepatoZYME-SFM (HZM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17705-021</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-21-hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4881</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indocyanine</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A606326</td>
			<td>For Indocyanine staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out SR Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31815-02</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NeAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>For hepatic progenitor differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR 5X Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR Basal Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin (OSM)</td>
			<td>peproTech</td>
			<td>300-10</td>
			<td>For hepatocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8901</td>
			<td>For CYP450 activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1281</td>
			<td>For PAS staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>For cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG</td>
			<td>ZSGB-BIO</td>
			<td>ZB-2305</td>
			<td>For WB,second antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Antibody Dilution Buffer for&#160;Western Blot</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0256</td>
			<td>For primary antibody dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReverTraAce qPCR RT Kit</td>
			<td>TOYOBO</td>
			<td>FSQ-101</td>
			<td>For cDNA Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiso Plus</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>9109</td>
			<td>For RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600669</td>
			<td>For second antibody preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td>For RT-PCR Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torin2</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-13002</td>
			<td>For definitive endoderm formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WXBB7485V</td>
			<td>For washing buffer preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient method for directed hepatocyte-like cell induction from human embryonic stem cells

الوظائف المحتملة للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية (HLCs) المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تبشر بالكثير لنمذجة الأمراض وتطبيقات فحص الأدوية. 10- إن هذه الطريقة هي طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتمايز مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى مركبات سداسية الهكربون الوظيفية. ويعتبر إنشاء سلالة من الاندوديرم خطوة رئيسية في التمايز بين المراكز العليا. من خلال طريقتنا، ونحن تنظيم مسارات الإشارات الرئيسية من خلال استكمال مستمر أكتيفين A وCHIR99021 خلال التمايز hESC إلى endoderm نهائي (DE)، تليها جيل من خلايا السلف الكبدي، وأخيرا HLCs مع مورفولوجيا خلايا الكبد نموذجية في طريقة حكمية مع الكواشف محددة تماما. وHESC المشتقة من HLCs التي تنتجها هذه الطريقة التعبير عن علامات مرحلة محددة (بما في ذلك الألبومين، مستقبلات HNF4α النووية، وتوروشولات الصوديوم cotransporting polypeptide (NTCP))، وتظهر خصائص خاصة تتعلق خلايا الكبد ناضجة والوظيفية (بما في ذلك تلطيخ الأخضر إيندوكيانين، تخزين الجليكوجين، تلطيخ hematoxylin-eosin والنشاط CYP3)، ويمكن أن توفر منصة لتطوير التطبيقات القائمة على HLC في دراسة أمراض الكبد.

الرسم التخطيطي لحث HLC من hESCs والصور التمثيلية ذات المجال الساطع لكل مرحلة تمايز تظهر في الشكل 1. في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة 3 أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية ، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجه?...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد (HLCs) من خلال استكمال أكتيفين A وCHIR99021 باستمرار أثناء التمايز hESC إلى بطانة الرحم النهائية (DE).

طريقة فعالة لتوجيه الخلايا الكبدية مثل التعريفي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

الخلايا الجذعية الجذعية البشرية المشتقة من خلايا الكبد مفيدة في نمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هذه طريقة فعالة وقابلة للاستنساخ لتحفيز تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بشكل فعال إلى خلايا وظيفية تشبه خلايا الكبد. حالة غير متمايزة والتقاء مناسب من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حاسمة للتمايز الناجح للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية.للحفاظ على الخلايا الجذعية، معطف العقيمة ستة آبار لوحات الأنسجة المعالجة مع ملليلتر واحد من 1X الإنسان الجنينية الخلايا الجذعية المؤهلة Matrigel لكل بئر، وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اتركي الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. إذابة HESEs المحفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق دون اهتزاز، ثم نقل الخلايا الجذعية على الفور عن طريق الأنابيب لهم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليلتر من قبل الحارة، 37 درجة مئوية mTESR المتوسطة.طرد مركزي HESEs و يستنشق supernatant، ثم بلطف إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسط mTESR. يستنشق المتوسط DMEM F-12 من لوحة. بذور الخلايا في لوحة من ستة آبار في كثافة 1 × 10 إلى الخلايا 5 في اثنين من ملليلتر من mTESR، واحتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.الحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال المتوسط مع mTESR مسخن المتوسطة يوميا. مرور الخلايا في ما يقرب من 70 إلى 80٪ التقاء، أو عندما تبدأ مستعمرات الخلية لإجراء اتصال. بالنسبة للخلايا التي تمرر ، يستنشق الوسط ويحتضن الخلايا بميليلتر واحد لكل بئر من محلول الإنزيم لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.نقل الخلايا عن طريق الأنابيب لهم في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر تحتوي على أربعة ملليلتر من DMEM F-12 مسبقا إلى 37 درجة مئوية. إعداد لوحات 24 جيدا عن طريق طلاء لهم مع 250 ميكرولتر من 1X hESC المؤهلين Matrigel المتوسطة. البذور hESCs في كثافة 1-1.5 مرات 10 إلى الخلايا 5 لكل بئر في 500 ميكرولتر من المتوسط mTESR.إضافة كل من أكتيفين ألف إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام لكل ملليلتر وCHIR99021 إلى تركيز نهائي من ثلاثة ميكرومولار في حجم مناسب من المرحلة المحمى مسبقا وسيطة التمايز الأساسية. بعد ثلاثة أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات خلايا إندوديرم نهائية، مثل FOXA2 و SOX17 و GATA4 و CXCR4 و FOXA1. في اليوم الثالث من التمايز، يستنشق الوسط، يستبدل بالمرحلة الثانية المتوسطة، ويحتضن لمدة 24 ساعة.تغيير المتوسطة كل يومين في الأيام من أربعة إلى ثمانية. بعد ثمانية أيام من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن العلامات المناسبة لخلايا السلف الكبدية، مثل HNF4 ألفا، AFP، TBX3، TTR، ALB، NTCP، CEBPA. في اليوم الثامن، يستنشق المرحلة الثانية المتوسطة من الخلايا، واستبدالها بالمرحلة الثالثة المتوسطة.السماح للخلايا باحتضان لمدة 10 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ، وتغيير الوسائط كل يومين مع عوامل التمايز المضافة حديثا. بعد 18 يوما من التمايز، يجب على الخلايا المتمايزة التعبير عن علامات مميزة للخلايا الكبدية، مثل AAT، ALB، TTR، HNF4 ألفا، NTCP، ASGR1، CYP3A4. يتم عرض الرسم التخطيطي للخلايا الشبيهة بالخلايا الكبدية من hESCs والصور الميدانية الساطعة لكل مرحلة تمايز.في المرحلة الأولى، تمت إضافة أكتيفين A وCHIR99021 لمدة ثلاثة أيام لحث الخلايا الجذعية على تشكيل خلايا إندوديرم. في المرحلة الثانية، تمايزت خلايا بطانة الرحم إلى خلايا سلف كبدية بعد علاجها بوسط تمايز لمدة خمسة أيام. في المرحلة الثالثة ، بعد 10 أيام ، نضجت خلايا الكبد المبكرة وتباينت إلى خلايا تشبه خلايا الكبد في عامل نمو خلايا الكبد والأونكوستاتين.في المرحلة النهائية من التمايز، أظهرت الخلايا النمط الظاهري الكبدي النموذجي. تم استخدام RT-PCR، وتلطيخ المناعة، والنشاف الغربي للكشف عن علامات خلايا الإندوديرم، وخلايا السلائف الكبدية، والخلايا الكبدية الناضجة. وأظهرت الخلايا المتمايزة مستويات عالية من التعبير عن الجينات والبروتينات ذات الصلة بالتمايز في كل مرحلة، مثل علامات endoderm SOX17 في اليوم الثالث، وعلامة السلائف الكبدية HNF4 ألفا في اليوم الثامن، ووكالة الصحافة الفرنسية في اليوم 14، وعلامة خلايا الكبد الناضجة ALB في اليوم 18.أظهرت HLCs تلطيخ أخضر وتلطيخ واسع النطاق لحمض السيتوبلازميك. وأظهرت خلايا الكبد مورفولوجيا ثنائية النواة نموذجية. تم تأكيد النشاط الأنزيمي ل CYP3A4 ، وهو CYP الأيضي الأساسي في الكبد في HLCs ، مع فحص إنزيم.إن وضع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية بكثافة مناسبة وبدء التمايز في التاريخ التالي أمران حاسمان. في المرحلة الأولى، المس الوسائط برفق لأن الخلايا عرضة للطفو. مزيج من activin A والجزيئات الصغيرة الأخرى قد تزيد من تحسين كفاءة التمايز، وإنتاج خلايا أكثر نضجا مثل خلايا الكبد في هذا الإجراء.يمكن أن توفر هذه التقنية منصة لاستكشاف زرع خلايا الكبد وهندسة أنسجة الكبد والكبد الاصطناعي الحيوي ونمذجة الأمراض.

طريقة فعالة لتوجيه الخلايا الكبدية مثل التعريفي من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Abstract