وقد تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الألمانية لأمراض القلب (زمالة أبحاث DGK ل GLS) ومؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG من خلال مشروع IRTG 1816 ل GLS و AD؛ DFG 417880571 وDFG TI 956/1-1 لMT; SFB 1002 TP C04 ل MT و WHZ; SFB 1002 TP S01 لWHZ; و EXC 2067/1-390729940J لWHZ). WHZ مدعوم من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للعلوم والتعليم (BMBF من خلال مشروع IndiHEART)، ومؤسسة Leducq (20CVD04). MT، WHZ و SL مدعومة من قبل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK).

ويجب اتخاذ جميع الخطوات في أغطية السلامة البيولوجية من الفئة الثانية المثبتة في المختبرات تحت مستوى الاحتواء 1. واعتمادا على اللوائح المحلية ونوع التلاعبات التي يتعين القيام بها، مثل نقل الجينات بوساطة فيروسية، يجب زيادة مستوى الاحتواء إلى مستوى السلامة البيولوجية 2 أو 3. يتم الحفاظ على ج...

يصف البروتوكول المقدم توليد العلاج بالصدمات الكهربائية من CF البشري الأساسي ، والذي يسمح بدراسة التأثير الميكانيكي لهذه الخلايا على بيئة المصفوفة خارج الخلية والعكس بالعكس.
تحتاج الخلايا الليفية إلى توسيعها لتسفر عن خلايا كافية لتجارب العلاج بالصدمات الكهربائية المخطط ل?...

عقبة رئيسية في دراسة الأمراض الليفية هو عدم وجود نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد البشرية التمثيلية التي توفر نظرة ثاقبة على سلوك الخلايا الليفية ومشتقاتها المرضية. لدراسة العمليات الليفية، نظم الثقافة 2D القياسية هي دون المستوى الأمثل منذ الخلايا الليفية المعزولة عبر بسرعة إلى α السلس العضلات actin (SMA) التعبير عن الخلايا العضلية الليفية عندما مثقف على الركائز 2D غير متوافق1،2،3. وهكذا، فإن الخلايا الليفية في الثقافة 2D القياسية لا تعكس النمط الظاهري الأنسجة "صحية" العادية3،4،5،6. وقد أدخلت الثقافات على الركائز مرنة لمحاكاة غير الليفية (10 كيلو باسكال) والألياف (35 كيلو باسكال) بيئات الأنسجة7، ولكن هذه تفتقر إلى البعد الثالث، وهو أمر مهم جدا فيما يتعلق بالفيزيولوجيا المرضية. توفر هندسة الأنسجة الفرصة للتغلب على هذا القيد من خلال السماح بزراعة الخلايا الليفية في مصفوفة خارج الخلية محددة وغير قادرة تجريبيا (ECM) - السياق ، على سبيل المثال ، عن طريق التعديلات في الخلوية ، وتكوين ECM ، وتركيز ECM ، وكلها يمكن أن تحدد الميكانيكا الحيوية للأنسجة.
وقد تم إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد مختلفة باستخدام الخلايا الليفية. كانت الأقراص العائمة والميكروسفيرات من بين الأقراص الأولى وتبين أن الكولاجين يتم تجديده وضغطه بطريقة تعتمد على الوقت. الخلايا الليفية تمارس قوى الجر على الفيبريلات الكولاجين، وهي عملية يمكن تسهيلها بإضافة عوامل مؤيدة للألياف مثل تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. ومع ذلك، لا تسمح الثقافات العائمة بحرية بالتحميل الخارجي الخاضع للرقابة، وبالتالي تشكل نماذج انكماش أو ضغط مستمرة. فتحت الأنسجة المهندسة الشبيهة بالصفائح إمكانية دراسة التنظيم المنزلي للخصائص الميكانيكية الحيوية للأنسجة ، أي من خلال اختبار الإجهاد الأحادي أو ثنائي أو متعدد الaxial أو الدوري17,18,19,20. وقد استخدمت هذه النماذج، على سبيل المثال، لإثبات تأثير عدد الخلايا على تصلب الأنسجة، والتي تبين أن ترتبط بشكل إيجابي مع سلامة الهيكل الخلوي وانقباض الهيكل الخلوي actomyosin18,19. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن التحويلات من القوة إلى السلالة معقدة بسبب تشوه الأنسجة غير الموحد حول نقاط المشبك من محولات القوة ونقاط الإرساء. يمكن تجاوز هذا القيد المتأصل من قبل الأنسجة على شكل عظم الكلب أو الحلقة ، مما يوفر بعض إنفاذ الأنسجة في نقاط الإرساء21,22,23. يمكن إعداد الأنسجة على شكل حلقة عن طريق توزيع هيدروجيل الكولاجين الخلية في قوالب على شكل حلقة. كما المضغوطة هيدروجيل، تشكل الأنسجة حول قضيب الداخلية غير قابلة للضغط من القالب، والذي يوفر مقاومة لمزيد من انكماش الأنسجة24,25,26,27. بعد الضغط الأولي والأقصى عادة ، يمكن أيضا نقل الأنسجة إلى الفواصل القابلة للتعديل لزيادة تقييد العلاج بالصدمات الكهربائية الدائرية بطول نسيج محدد3,24,25,26,27,28,29,30. يمكن تقييم الخصائص الفيزيائية الحيوية في أجهزة الإجهاد الإجهاد الأفقي أو الرأسي القياسية مع خلايا الحمل المناسبة تحت سلالة أحادية الاتجاه أو ديناميكية3. كما الأنسجة لديها هيكل دائري موحد إلى حد كبير ويمكن أن تعقد على القضبان / السنانير (نقاط مرسى و / أو محولات القوة)، على الرغم من أن هذه قد لا تزال ترفق مناطق الضغط حول أشرطة التحميل، وهذا الشكل يسمح للاختلاف سلالة أكثر اتساقا بالمقارنة مع لقط3. وعلاوة على ذلك، الأنسجة الراسية تثير شكل خلية ثنائي القطب، والخلايا تتكيف مع قوى الأنسجة عن طريق الاستطالة على طول خطوط القوة تعزيز الجر النظائري31,32,33,34,35,36. لقد طبقنا سابقا العلاج بالصدمات الكهربائية على شكل حلقة من الخلايا الليفية القلبية الجرذة والبشرية (CF) حول قطب واحد متصلب في تجارب إجهاد الإجهاد الوظيفية وأجرينا دراسات اكتساب وفقدان الوظائف باستخدام الخلايا الليفية المنقولة فيروسيا24,25,26 والدراسات الدوائية37. علاوة على ذلك ، يمكننا تحديد الاختلافات الجنسية في التليف بوساطة CF في نموذج العلاج بالصدمات الكهربائية27.
البروتوكول التالي لتوليد العلاج بالصدمات الكهربائية البشرية ، وتجسدت مع CF الإنسان الأولية التي تم الحصول عليها كشهادة كريوبريخدم CF من البائعين التجاريين (انظر جدول المواد) ، يجمع بين مزايا الأنسجة على شكل حلقة مع طريقة سهلة وسريعة لإنتاج الأنسجة العيانية لمنصة 48 جيدا مصممة لاختبار المحتوى العالي الموازي.
الأهم من ذلك، لا يقتصر نموذج العلاج بالصدمات الكهربائية على نوع معين من الخلايا الليفية، مع الاستخدام الموثق في التحقيق في الخلايا الليفية الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا الليفية الجلدية38،39. وعلاوة على ذلك ، فإن الخلايا الليفية من خزعات المريض تعمل بشكل جيد على قدم المساواة ، واختيار الخلايا الليفية يعتمد في نهاية المطاف على المسألة العلمية التي سيتم معالجتها.
المنصة المستخدمة لتوليد العلاج بالصدمات الكهربائية الموصوفة في هذا البروتوكول هي لوحة زراعة خلايا/أنسجة ثلاثية الأبعاد متاحة تجاريا 48 جيدا (الشكل 1A). يتم وصف طرق إعداد وزراعة ورصد تكوين العلاج بالصدمات الكهربائية ووظيفتها تحت هندسة محددة والحمل الميكانيكي بمساعدة لوحة 48 بئرا. يتم عقد العلاج بالصدمات الكهربائية شكلت من قبل أعمدة مرنة متكاملة ويمكن ضبطها الحمل الميكانيكي وفقا للغرض النهائي باستخدام أعمدة مع صلابة مختلفة (الشاطئ قيمة 36-89)، مما يؤثر على صلابة الانحناء. ينصح البولنديين مع الشاطئ قيمة 46. البروتوكول هو، بالإضافة إلى ذلك، متوافقة مع قالب دائري مخصص وصفها سابقا، حيث يقام العلاج بالصدمات الكهربائية حول قضيب واحد قاسية37. يتم إعطاء أبعاد هذا القالب في الشكل 1B.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> الشكل 1: التمثيل التخطيطي للقوالب الصب. (أ) الرسم الفني وأبعاد قالب الصب مع اثنين من أعمدة مرنة. يتكون القالب من محيط داخلي محدد بجدار قصير يحمل أعمدة احتفاظ مزدوجة في الجسم الرئيسي للقالب. القطبين مرنة لديها مسافة أفقية حرة إلى بعضها البعض ومتصلة في القاعدة. يسمح القالب لحجم الصب 180 ميكرولتر. بئر كل قالب يسمح قدرة حجم ما لا يقل عن 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية. يمكن استخدام تركيبات مواد مختلفة لإنتاج أعمدة ذات صلابة محددة (على سبيل المثال، TM5MED-TM9MED). (ب) الرسم الفني وأبعاد قالب على شكل حلقة مع قضيب واحد قاسية. هذا هو قالب بديل مع الهندسة المتميزة والبيئة الميكانيكية، والتي يمكن استخدامها مع بروتوكول الصب ECT37. تم تكييف طريقة تجميع العفن على شكل حلقة من الأشكال الأكبر المنشورة28,41. باختصار، تتضمن الطريقة (1) بصمة الفواصل البوليتيترافلوروإيثيلين (PTFE) (قطرها 8 مم) في البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS، السيليكون) سكب في أطباق زجاجية (قطرها 60 ملم)، و (2) تحديد حامل القطب PDMS (قطر 1.5 ملم) متحدة المركز داخل تجويف مجوف شكلت، والذي يعمل على (3) عقد قطب قابلة للإزالة (4 مم قطر أنبوب السيليكون). المساحة المجوفة الناتجة تسمح ل180 ميكرولتر من حجم الصب. يمكن لكل طبق زجاجي أن يغلف قوالب مطبوعة متعددة (تظهر بشكل مثالي مع 5 قوالب) ولديه القدرة على ما يصل إلى 5 مل من متوسط الثقافة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagent &#8211; TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12100061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBM&#160;Fibroblast Growth Basal Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,&#160;Supplements and Growth Factors</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Medium 3 KIT</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Basal Medium 3</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-23230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Medium 3 SupplementPack</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-39350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 &#956;L/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2770-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell sources:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-12377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC- 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen sourses:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl</td>
			<td>LLC Collagen Solutions</td>
			<td>FS22024</td>
			<td>6-7 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>~4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latrunculin-A (Lat-A)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-T119-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ware:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plastic ware</td>
			<td>Sarstedt and Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 &#956;m)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myrPlate-uniform</td>
			<td>myriamed GmbH</td>
			<td>TM5 med</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific instruments:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bi-telecentric CORE lens for 1/2&#8243; detectors</td>
			<td>OptoEngineering</td>
			<td>TCCR12096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Area scan camera Basler ace acA4024</td>
			<td>Basler</td>
			<td>107404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fibroblast derived human engineered connective tissue for screening applications

الخلايا الليفية هي خلايا ديناميكية للغاية بشكل حيوي ، والتي تتحول بسرعة إلى الخلايا العضلية الليفية استجابة للمحفزات الكيميائية الحيوية والميكاناميكية الحيوية. الفهم الحالي للعمليات الليفية، بما في ذلك التليف القلبي، لا يزال ضعيفا، مما يعوق تطوير علاجات جديدة مضادة للأورام الليفية. نظم نموذج الإنسان يمكن التحكم فيها وموثوق بها حاسمة لفهم أفضل لعلم الأمراض التليف. هذا بروتوكول قابل للاستنساخ وقابل للتطوير للغاية لتوليد الأنسجة الضامة المهندسة (ECT) في لوحة صب 48 جيدا لتسهيل دراسات الخلايا الليفية والفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الليفية في بيئة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد). يتم إنشاء العلاج بالصدمات الكهربائية حول القطبين مع صلابة غير قادرة، مما يسمح للدراسات تحت حمولة ميكانيكية حيوية محددة. في ظل ظروف التحميل المحددة ، يمكن دراسة التعديلات الظاهرية التي تسيطر عليها تفاعلات مصفوفة الخلية. الاختبار الموازي ممكن في شكل 48 جيدا مع فرصة لتحليل المسار الزمني لمعلمات متعددة ، مثل ضغط الأنسجة والانكماش ضد الحمل. من هذه المعلمات، يمكن دراسة الخصائص الميكانيكية الحيوية مثل تصلب الأنسجة والمرونة.

تصل ECT إلى حوالي 95 ٪ ضغط مقارنة بحجم هيدروجيل الكولاجين الخلوي الأولي خلال أول 24 ساعة. ضغط الأنسجة والانكماش تحت ظروف السيطرة وفي وجود FCS تستتبعه بضع ساعات بعد الصب ويزيد بشكل ملحوظ حتى اليوم 5 (الشكل 5A). وقد يزداد انحراف القطب خلال الأيام ال 15 التالية (20 يوما هي أطول فترة تم اخ...

Watch this Scientific Journal Video about Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications at JoVE.com

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

يقدم هنا بروتوكول لتوليد الأنسجة الضامة المهندسة لثقافة موازية من 48 أنسجة في لوحة متعددة الآبار مع أعمدة مزدوجة ، ومناسبة للدراسات الميكانيكية ، ونمذجة الأمراض ، وتطبيقات الفحص. البروتوكول متوافق مع الخلايا الليفية من مختلف الأعضاء والأنواع ويتجلى هنا مع الخلايا الليفية القلبية الأولية البشرية.

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

يسمح هذا البروتوكول لبناء الخلايا الليفية وتنظيم بيئتها الخاصة في ظل ظروف ميكانيكية محددة. هذه النتائج في الأنسجة غير المنظائرة مع صلابة والتراكيب مصفوفة مماثلة للبيئة الطبيعية للخلية. يسمح هذا الأسلوب لمقارنة ما يصل إلى 48 الشروط بالتوازي.وهي مرنة فيما يتعلق بنوع الخلية المستخدمة وظروف الثقافة. وباستخدام عدد قليل فقط من المكونات المحددة جيدا، يمكن استنساخها بين المختبرات. من خلال تطبيق العوامل المؤيدة للورم الليفي أو الأدوية المضادة للألياف ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العمليات والعلاجات الأساسية للأمراض الليفية من أي نوع.إثبات الإجراء سيكون أليسا ديغريف، طالبة دكتوراه من مختبرنا، وأنا. في البداية، إذابة الخلايا الليفية القلبية المحفوظة بالتبريد في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين تقريبا حتى يتم ترك القارورة مع كمية صغيرة فقط من الجليد. بعد ذلك، نقل تعليق الخلية دروبوايز باستخدام ماصة المصلية ملليلتر اثنين في أنبوب الطرد المركزي العقيمة المناسبة التي تحتوي على 10 ملليلتر من المتوسط نمو الخلايا الليفية.للحصول على أفضل استرجاع للخلايا، اشطف القارورة المبردة بميليلتر واحد من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. إعادة إنفاق الخلايا بلطف ونقلها إلى قارورة ثقافة الخلية. تجديد تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية كل يومين لمدة خمسة أيام أو حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪.بعد قرصنة الوسط من الخلايا المستزرعة ، وغسل الخلايا مع ستة ملليلتر من برنامج تلفزيوني والطفارات ، ثم إضافة ستة ملليلترات من كاشف تفكك الخلية إلى الخلايا واحتضان حتى انفصال الخلية مرئية. تحييد النشاط الأنزيمي بإضافة ستة إلى 12 ملليلتر من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية إلى الخلايا المطرودة في كاشف ارتباط الخلية. ماصة بلطف صعودا وهبوطا أربع إلى ثماني مرات باستخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لضمان تعليق خلية واحدة ونقل الخلايا إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر جديدة.تحقق من العائد بمساعدة عداد الخلية الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بيليه أسفل الخلايا. بعد الطرد المركزي، يستنشق الفائق، نفض الغبار عن أنبوب لطرد بيليه وإعادة تثبيت الخلايا في تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية. بعد ذلك، قم بإجهاد تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية شبكية 40 ميكرومتر، ثم استخدم عداد خلايا آلي، وقيم رقم الخلية وقابليتها للحياة عن طريق استبعاد التيار الكهربائي لضمان أرقام خلايا موثوقة قبل الشروع في الأنسجة الضامة المهندسة أو إعداد العلاج بالصدمات الكهربائية.للتحضير ل العلاج بالصدمات الكهربائية، قم بتعديل تعليق الخلية إلى 8.9 مليون خلية لكل ملليلتر عند 20 إلى 25 درجة مئوية عن طريق إضافة تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية والحفاظ على الخلايا على الجليد. نقل جميع الأنابيب الأخرى التي تحتوي على مكونات فردية من خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية على الجليد وقبل البرد فارغة 50 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي لإعداد الخليط. ابدأ في إعداد خليط هيدروجيل ECT بإضافة المكونات الموضحة في النص إلى أنبوب الطرد المركزي المبرد مسبقا 50 ملليلتر لتجنب تكوين فقاعة الهواء.أولا، ماصة حمض الكولاجين القابل للذوبان نوع I هيدروجيل في ماصة المصلية مع طرف تتحمل واسعة. ضبط محتوى الملح من محلول الكولاجين عن طريق إضافة DMEM في حين يحوم بلطف أنبوب لخلط السليم. لتحييد درجة الحموضة، أضف 0.2 هيدروكسيد الصوديوم المولي أثناء تدوير الأنبوب وتأكيد تحييد عن طريق مراقبة اللون الأحمر لمؤشر الفينول الأحمر.ثم أضف تعليق الخلية إسقاط بينما يحوم بلطف الأنبوب. خلط تعليق عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة فقط باستخدام ماصة المصلية مع طرف تتحمل واسعة لتجنب تشكيل فقاعة وتقليل الإجهاد القص. دوامة بلطف أنبوب 10 مرات لخلط شامل.احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خليط هيدروجيل ECT على الثلج طوال عملية الصب. الرطب طرف ماصة ملليلتر واحد في خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية، ثم توزيع 180 ميكرولتر من خليط الهيدروجيل بالتساوي في كل قالب من لوحة الصب 48 جيدا تجنب قوى القص المفرطة التي قد تؤثر على سلامة تجميع مصفوفة الكولاجين وضمان أن لوحة كاملة تنتهي في 15 إلى 20 دقيقة. تأكد من أن أشكال حلقة كاملة داخل القالب والتوزيع المتقطع لخليط العلاج بالصدمات الكهربائية سيمنع تشكيل حلقة العلاج بالصدمات الكهربائية كاملة.تجنب الأنابيب في البئر الداخلية وتشكيل فقاعات أثناء pipetting لضمان الصب هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية موحدة لتشكيل الأنسجة متجانسة ووظيفية. ضع بعناية لوحة الصب 48 جيدا داخل حاضنة ثقافة الخلية لإعادة تشكيل خليط هيدروجيل العلاج بالصدمات الكهربائية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة ، يبدو مثل هلام ومبهمة.أضف 600 ميكرولتر من 37 درجة مئوية من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية الدافئ لكل بئر على طول الجدار بلطف لتجنب انفصال العلاج بالصدمات الكهربائية عن القاع. استبدل الوسط كل يوم ب 500 ميكرولتر من تشويه الأعضاء التناسلية الأنثوية حتى التحليل. في النقاط الزمنية المطلوبة، استخدم مجهر ستيريو لتسجيل الصور المجهرية للمناظر العلوية والجانبية ل ECT.استخدم برنامج معالجة الصور لإجراء تحليل مسح خطي. قم بتعيين مقياس واستخدم أداة الخط المستقيم لتتبع وقياس أقطار العلاج بالصدمات الكهربائية بحد أدنى ستة مواقع لكل ذراع في كل طائرة تصوير. صورة لوحة الصب 48 جيدا تحت جهاز تسجيل مع كاميرا مسح منطقة متكاملة وضعت على مسافة ثابتة مجهزة عالية الدقة استشعار صورة أحادية اللون ومصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية القريبة.إجراء الكشف الآلي للأقطاب'نصائح تحتوي على صبغة الفلورسنت لتعظيم التباين. قياس المسافة بين القطبين من السجلات اليومية باستخدام تحليل الآلي عن طريق تشغيل الصور المسجلة على البرمجيات للكشف عن بكسل مشرق عالية التباين على خلفية مظلمة أو برنامج معالجة الصور. إزالة العلاج بالصدمات الكهربائية من الاحتفاظ أعمدة وإدراج ربط نقل وحلقة العلاج بالصدمات الكهربائية.ثم نقل العلاج بالصدمات الكهربائية على اثنين من السنانير فرضت على الذراع الثابتة وذراع محول من ريومتر الميكانيكية الديناميكية التمديدية مجهزة حمام الجهاز 37 درجة مئوية خفف مليئة برنامج تلفزيوني. تطبيق التوتر أحادية الجنس بمعدل خطي ثابت عن طريق تعيين ريومتر في حوالي 1٪ من المسافة الأولية بين السنانير في الثانية الواحدة. يمكن استخدام معدل تمدد ثابت يبلغ 0.03 ملليمتر في الثانية مع أبعاد العلاج بالصدمات الكهربائية النموذجية.المسيل للدموع قوة محول وبدء تمتد. استمر في التسجيل حتى نقطة تمزق العلاج بالصدمات الكهربائية بعد تطبيع القوة المقاسة حسب المنطقة المقطعية العرضية ورسم منحنى الإجهاد الإجهادي لتحديد المعلمات الميكانيكية الحيوية المختلفة. قبل أن يبدأ النسيج في التكسير الدقيق ، يتوافق الحد الأعلى للمنطقة المرنة مع نقطة الغلة وسلالته هي مقياس لمرونة الأنسجة.منطقة البلاستيك بين نقطة الغلة ونقطة الفشل. تتوافق نقطة الفشل مع انخفاض مفاجئ في الإجهاد بسبب تمزق الأنسجة ، وتحديد السلالة النهائية التي هي مقياس لتمدد الأنسجة. نقطة القياس الثالثة يتوافق مع أقصى قوة محددة من قبل أعلى الإجهاد أن الأنسجة يمكن أن تتحمل دون كسر خلال فترة التمدد.المرونة والصلابة التي تعطيها المنطقة تحت المنحنى يتوافق مع الطاقة التي يمتصها النسيج حتى نقطة الغلة ونقطة الفشل على التوالي. لكل منحنى تم الحصول عليه، يتوافق منحدر الجزء الخطي من المنطقة المرنة مع معامل يونغ، المعروف أيضا باسم معامل المرونة. وهي خاصية الميكانيكية التي تقيس صلابة الأنسجة.باستخدام هذا البروتوكول، ECT الضغط والانكماش في ظل ظروف السيطرة وفي وجود FCS تلت بضع ساعات بعد الصب وزيادة ملحوظة تصل إلى اليوم الخامس. عندما عولج العلاج بالصدمات الكهربائية مع مثبط البلمرة أكتين Latrunculin A، تم تخفيض ضغط العلاج بالصدمات الكهربائية كما هو مبين من قبل منطقة المقطع العرضي أعلى بكثير بالمقارنة مع السيطرة. تم تقييم تقلص الأنسجة خلال الأيام الخمسة من الثقافة.في غياب لاتورونكولين A، زاد الانكماش تدريجيا حتى اليوم الخامس ليصل إلى حوالي 40٪انكماش. ومع ذلك، أثر وجود Latrunculin A على تقلص الأنسجة مما أدى إلى انكماش 20٪ كحد أقصى فقط. أدى تثبيط البلمرة Actin إلى انخفاض كبير بنسبة 50٪ تقريبا في تصلب الأنسجة على التحكم.هذه النتائج تثبت أن سلامة الهيكل الخلوي actin ضروري لضغط العلاج بالصدمات الكهربائية, انكماش, وتصلب. من المهم تحديد حل الكولاجين الموثوق عالي الجودة وضمان استخدام تعليق أحادي الخلية ذو قابلية عالية للحياة لإعادة تشكيل الأنسجة الضامة المهندسة.

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Abstract