אנו מודים למרים בנינג על התמיכה הטכנית. אנו מכירים בתמיכה של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ל- A.P.), ספארק ומכון הבריאות של ברלין (BIH) (קרנות אימות BIH ל- A.P.), הקרן המאוחדת למחלות מיטוכונדריאליות (UMDF) (מענק הקונסורציום הבינלאומי של תסמונת לי ל- A.P.), דיסלדורף של בית החולים האוניברסיטאי (Forschungskommission UKD ל- A.P.), ומשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) (ה: ביו חוקר צעיר להעניק AZ 031L0211 לא.פ.). העבודה במעבדה של C.R.R. נתמכה על ידי DFG (עבור 2795 "סינפסות תחת לחץ", Ro 2327/13-1).

הערה: השימוש ב- IPSCs אנושי עשוי לדרוש אישור אתי. iPSCs בשימוש במחקר זה נגזרו מאנשים בקרה בריאה לאחר אישור אתי מקומי (#2019-681). כל נהלי תרבית התא חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, בזהירות חיטוי כל ריאגנטים ומתכלים לפני המעבר מתחת למכסה המנוע. IPSCs אנושי המשמש לבידול צריך להיות מספר מ...

<ol>
	<li>Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monogenic+mitochondrial+disorders.">Monogenic mitochondrial disorders.</a> New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).</li><li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases.">Mitochondrial diseases.</a> Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).</li><li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle.">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).</li><li>Carelli, V., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA:+impacting+central+and+peripheral+nervous+systems.">Mitochondrial DNA: impacting central and peripheral nervous systems.</a> Neuron. 84 (6), 1126-1142 (2014).</li><li>Russell, O. M., Gorman, G. S., Lightowlers, R. N., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+hope+for+the+future.">Mitochondrial diseases: hope for the future.</a> Cell. 181 (1), 168-188 (2020).</li><li>Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+for+the+therapy+of+mitochondrial+diseases.">Drug development for the therapy of mitochondrial diseases.</a> Trends in Molecular Medicine. 26 (1), 40-57 (2020).</li><li>Tyynismaa, H., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+mitochondrial+DNA+defects+and+their+relevance+for+human+disease.">Mouse models of mitochondrial DNA defects and their relevance for human disease.</a> EMBO Reports. 10 (2), 137-143 (2009).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+rescue+in+pluripotent+cells+from+patients+with+mtDNA+disease.">Metabolic rescue in pluripotent cells from patients with mtDNA disease.</a> Nature. 524 (7564), 234-238 (2015).</li><li>Galera-Monge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+calcium+dysregulation+in+Leigh+syndrome+induced+pluripotent+stem+cell+derived+neurons.">Mitochondrial dysfunction and calcium dysregulation in Leigh syndrome induced pluripotent stem cell derived neurons.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (9), 3191 (2020).</li><li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+neuronal+energy+deficiency+by+mTOR+inhibition+as+a+treatment+for+mitochondria-related+neurodegeneration.">Alleviation of neuronal energy deficiency by mTOR inhibition as a treatment for mitochondria-related neurodegeneration.</a> Elife. 5, 13378 (2016).</li><li>Lorenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+neural+progenitors+are+an+effective+drug+discovery+model+for+neurological+mtDNA+disorders.">Human iPSC-derived neural progenitors are an effective drug discovery model for neurological mtDNA disorders.</a> Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+induced+pluripotent+stem+cell-based+drug+discovery+for+mitochondrial+disease.">Concise review: induced pluripotent stem cell-based drug discovery for mitochondrial disease.</a> Stem Cells. 35 (7), 1655-1662 (2017).</li><li>Chiaradia, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+organoids+for+the+study+of+human+neurobiology+at+the+interface+of+in+vitro+and+in+vivo.">Brain organoids for the study of human neurobiology at the interface of in vitro and in vivo.</a> Nature Neuroscience. 23 (12), 1496-1508 (2020).</li><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocol. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li><li>Liput, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+approaches+for+analyzing+the+role+of+mitochondria+in+health,+development+and+disease+using+human+cerebral+organoids.">Tools and approaches for analyzing the role of mitochondria in health, development and disease using human cerebral organoids.</a> Developmental Neurobiology. , (2021).</li><li>Winanto, K. Z. J., Soh, B. S., Fan, Y., Ng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+of+MELAS+neural+cells+reveal+hyperactive+Notch+signaling+that+impacts+neurodevelopment.">Organoid cultures of MELAS neural cells reveal hyperactive Notch signaling that impacts neurodevelopment.</a> Cell Death and Disease. 11 (3), 182 (2020).</li><li>Romero-Morales, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+cerebral+organoids+model+features+of+Leigh+Syndrome+and+reveal+abnormal+corticogenesis.">Human iPSC-derived cerebral organoids model features of Leigh Syndrome and reveal abnormal corticogenesis.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Inak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+metabolic+programming+impairs+early+neuronal+morphogenesis+in+neural+cultures+and+an+organoid+model+of+Leigh+syndrome.">Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome.</a> Nature Communications. 12 (1), 1929 (2021).</li><li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodevelopmental+manifestations+of+mitochondrial+disease.">Neurodevelopmental manifestations of mitochondrial disease.</a> Journal of Developmental &amp; Behavioral Pediatrics. 31 (7), 610-621 (2010).</li><li>Velasco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).</li><li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells.">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li><li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse.">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386 (2021).</li><li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function:+from+animal+models+to+human+brain+organoids.">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry &amp; Cell Biology. 123, 105760 (2020).</li><li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids.">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li></ol>

מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומ?...

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים1. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)2, הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.
אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאליות הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את קורס המחלה האנושית6. כמה מהמודלים החייתיים הנחקרים כיום אינם מציגים את הפגמים הנוירולוגיים הקיימים בחולים7. לפיכך, המנגנונים שבביד הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות עדיין אינם מובנים במלואם.
מחקרים אחרונים יצרו IPSCs מחולים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות והשתמשו בתאים אלה כדי להשיג תאים עצביים ספציפיים לחולה. לדוגמה, פגמים גנטיים הקשורים למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, נמצאו כגורמים לסטיות בביו-אנרגטיקה תאית8,9, סינתזת חלבונים10 וסידן הומאוסטזיס9,11. דיווחים אלה סיפקו רמזים מכניים חשובים על הליקוי העצבי המתרחש במחלות מיטוכונדריאליות, וסללו את הדרך לגילוי תרופות למחלות חשוכות מרפא אלה12.
תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), לעומת זאת, אינן מאפשרות לחקור את המורכבות האדריכלית והארגון האזורי של איברים תלת-ממדיים13. לשם כך, השימוש באורגנוידים מוחיים תלת-ממדיים הנגזרים מ- iPSCs14 ספציפי למטופל עשוי לאפשר לחוקרים להשיג מידע חשוב נוסף ובכך לעזור לנתח כיצד מחלות מיטוכונדריאליות משפיעות על התפתחותה ותפקודה של מערכת העצבים15. מחקרים המעסיקים אורגנוידים במוח שמקורם ב- IPSC כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות מתחילים לחשוף את המרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. 
אורגנוידים חוט השדרה נושא מוטציות הקשורות למחלה המיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית, ותסמונת פרקים דמויי שבץ (MELAS), הראו נוירוגנזה פגומה ובידול נוירון מוטורי מושהה16. אורגנוידים קליפת המוח נגזרים מחולים עם המחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, הראו גודל מופחת, פגמים ביצירת ניצני אפיתל עצביים, ואובדן ארכיטקטורה קליפת המוח17. אורגנוידים במוח מחולי תסמונת לי הראו כי פגמים המחלה ליזום ברמה של תאי אבות עצביים, אשר לא יכול להתחייב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי, גרימת הסתעפות עצבית חריגה מורפוגנזה18. לכן, אבות עצביים עשויים לייצג יעד טיפולי תאי למחלות מיטוכונדריאליות, ואסטרטגיות לקידום תפקודם המיטוכונדריאלי עשויות לתמוך בהתפתחות התפקודית של מערכת העצבים.
השימוש באורגנוידים במוח עשוי לעזור לחשוף את הרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. מחלות מיטוכונדריאליות נחשבות בעיקר ניוון עצבי מוקדם5. עם זאת, פגמים נוירו-התפתחותיים קיימים גם בחולים המושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, כולל עיכוב התפתחותי ופגיעה קוגניטיבית19. אורגנוידים מוחיים ספציפיים לחולה עשויים לעזור לטפל בהיבטים אלה ולפרט כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות המוח האנושי. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה יכול גם לשחק תפקיד פתוגנטי במחלות נוירולוגיות נפוצות יותר, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון4. לפיכך, לפרט את ההשפעה של פגמים מיטוכונדריאליים נוירו-פיתוח באמצעות organoids המוח עשוי גם להיות אינסטרומנטלי לחקר מחלות אלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור שניתן להשתמש בהם לביצוע מודל מחלות של מחלות מיטוכונדריאליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Affinity Designer</td>
			<td>Serif (Europe) Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Layout software; Vector graphics editor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SAB4600033-250UL</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-31571</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III (TUJ-1)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8578</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 with Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>3% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-0811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Star cell culture 6 well plate</td>
			<td>Greiner-Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically Defined Lipid Concentrate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11905031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope C1</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Modular confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrix component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31330038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2660-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP180C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP192C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Cy3</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AP182C</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DS-Q1Mc camera</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse 90i upright widefield microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse E 600FN upright microscope</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ts2 Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon Microsope Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software for confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>370-86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>747715</td>
			<td>Inverted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium-Neon Laser</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td></td>
			<td>Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H3149-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACell 240i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J 1.53c</td>
			<td>Wayne Rasband National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Image processing Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser (407 nm)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Map2</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>No. 188004</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxisafe 2030i</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stemcell Technology</td>
			<td>85850</td>
			<td>iPSC medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge X3R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10325804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td># LT07-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle for single usage (23G x 1&#8221; TW)</td>
			<td>Neoject</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>To draw hydrophobic barrier on slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System kit</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>818715</td>
			<td>4% in PBS, store solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette 7mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1681</td>
			<td>Graduated up to 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&#160; &#8734;/0.17 WD 1.0</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Dry Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 &#8734;/0.17 WD 0.13</td>
			<td>Nikon Microscope Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Oil Immersion Microscope Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish (100 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>664161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Glass Antifade Moutant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qualitative filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>516-0813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Inhibitior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11178</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB-431542</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>13031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburq</td>
			<td>1110918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI312</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>837904</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>31437-1kg-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-17320</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco/StemPro</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Reagent A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue Gel</td>
			<td>UHU</td>
			<td>63261</td>
			<td>adhesive gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe for single usage (1 mL)</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB2 Thermoblock</td>
			<td>Biometra</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 24 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Plate 6 Well</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFbeta3</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>51032711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOM20</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-11415</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td>
			<td>Wilkinson Sword</td>
			<td>70517470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Benchkote</td>
			<td>Merck/Sigma</td>
			<td>28418852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>3378738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF 96 extracellular flux analyser</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100737-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Assay DMEM Medium</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>103680-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 FluxPak (96-well microplate)</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human brain organoids for mitochondrial disease modeling

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור החזק של organoids עגול (איור 1A). האורגנוידים שנוצרו מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים (SMI312) ודנדריטים (חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2)) (איור 1B). אורגנוידים בוגרי?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling at JoVE.com

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

פרוטוקול זה נועד להשתמש אורגנוידים במוח כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות. הוא פותח ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור בהערכת תכונות המיטוכונדריה שלהם. שיטה זו אינה דורשת ביו-רה-קטרים יקרים והליכי הטמעה גוזלי זמן.לכן, קל ליישם ויוקרתי. פרוטוקול זה מאפשר ליצור אורגנוידים במוח לשחזור ולבדוק את תכונות המיטוכונדריה שלהם. זה יכול להוביל לזיהוי של מטרות התערבותיות למחלות מיטוכונדריה בלתי ניתנות לטיפול.בתור התחלה, תרבות IPSCs אנושי בתנאים ללא הזנה ב- iPSC בינוני על צלחות מצופות שש בארות ולשמור אותם בחממה תרבית רקמות לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. מעבר IPSCs ב 80% conencency באמצעות מדיום ניתוק ללא אנזימים ביחסים הנעים בין אחד על ארבעה לאחד על 12. כדי להגביר את הישרדות התא, להוסיף 10 מיקרומולר הקשורים רו חלבון קינאז או מעכב ROCK לאחר כל פיצול.נתק את 80% iPSCs ביום אפס. הכן הבחנה קליפת המוח בינוני אחד או CDM1 מראש לחמם אותו בטמפרטורת החדר לפני הוספתו לתאים. לשטוף את הבארות המכילות את iPSCs עם PBS כדי להסיר תאים מתים ופסולת.הוסיפו 500 מיקרוליטרים של ריאגנט A מחומם מראש לכל באר ודגרו במשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק תאים. הוסף מיליליטר אחד של iPSC בינוני כדי לדלל reagent A כדי לנטרל את פעילותה.השתמש 1,000 צנרת מיקרוליטר כדי לנתק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגות בעדינות IPSCs ב 125 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בזהירות לשאוף supernatant כדי למנוע הפרעה גלולה התא. resuspend הכדור עם מיליליטר אחד של CDM1 כדי לקבל השעיה תא יחיד ולספור את מספר התא.הכן את מדיום הזריעה עם 9, 000 iPSCs לכל 100 מיקרוליטרים ב- CDM1 בתוספת מעכב רוק מיקרומולרי 20, שלושה מעכבי קטנין WNT מיקרומולרי או IWR-1, וחמישה מיקרומולרים SB-431542. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיום זריעה לבאר לצלחת תחתונה V של 96 באר. שמור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.כדי ליצור נוירוספרות, ביום הראשון, שימו לב שצבירת תאים עגולים עם גבולות חלקים מוגדרים נוצרים. שים לב לתאים המתים סביב האגרגטים. המשך לתרבות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ביום השלישי, להסעיר את הצלחת על ידי הקשה על הצדדים שלוש פעמים כדי לנתק תאים מתים, ולאחר מכן להוסיף 100 microliters של CDM1 בתוספת 20 מעכבי ROCK מיקרומולרי, שלושה IWR-1 מיקרומולרי, וחמישה מיקרומולרים SB-431542 לכל באר. שמור את הצלחת לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום השישי, הסר בזהירות 80 מיקרוליטרים של המדיום העל-טבעי מכל באר.הימנעו מלגעת בתחתית הבאר. הוסף 100 מיקרוליטרים של CDM1 בתוספת שלושה מיקרומולרים IWR-1 וחמישה מיקרומולרים SB-431542 לכל באר ודגרת הצלחת. חזור על השלב הקודם לאחר כל שלושה ימים עד יום 18.ביום 18, כדי להעביר נוירוספרות, להכין CDM2 ולהוסיף 10 מיליליטר ללוח תרבית תא חיבור נמוך במיוחד 100 מ"מ. השתמש פיפטה 200 microliter עם קצה מנותק כדי להעביר את הנוירוספרות העגולות מהצלחת 96-well ללוח תרבית תא 100 מילימטר נמוך במיוחד. הסר חמישה מיליליטר של בינוני מהצלחת המכילה את הנוירוספירות ולהוסיף חמישה מיליליטר של CDM2 טרי.מניחים את הלוח על שייקר מסלולית ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבית רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כל שלושה ימים, שאפו בזהירות את המדיום העל-טבעי והחליפו אותו ב-CDM2 טרי. השאירו כמות קטנה של המדיום כדי למנוע נוירוספרות להתייבש.ביום ה-35, הכינו את CDM3. שואפים את המדיום מהצלחת ומוסיפים 10 מיליליטר של CDM3 קר. לאחר שינוי המדיום, מניחים את הלוח בחזרה על שייקר מסלולית ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.שנה את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים בהתאם לקצב הצמיחה כפי שצוין על ידי צבע המדיום. ביום ה-70, הכינו את CDM4. השתמש CDM4 בינוני עד הגיל הרצוי של organoids הוא הגיע.במהלך תקופה זו, לשמור את הלוח על שייקר מסלולית להגדיר ב 70 סיבובים לדקה בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום כל שלושה עד חמישה ימים בהתאם לקצב הצמיחה. הכן פתרון 4%PFA והצב אותו מתחת למכסה בטיחות.לאסוף organoids המוח בעדינות להעביר אותם עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מיליליטר קהה לצלחת שש באר מלא PFA. שמור את האורגנוידים בתמיסת PFA למשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את PFA עם פיפטה פסטר פלסטיק שלושה מיליליטר ולשטוף את organoids קבוע שלוש פעמים באמצעות PBS.יש לאחסן את האורגנוידים הקבועים בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS עד לשימוש נוסף. האורגנוידים הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים ודנדריטים. organoids בוגר מכילים לא רק תאים עצביים, אלא גם תאי גליה.באמצעות ניתוח אורגנוידים במוח פרוס, ניתן לפקח על אקסונים חיוביים SMI 312 ו- MAP2 דנדריטים חיוביים או תאי גליית בטא S100. יתר על כן, תמונות קונפוקליות לעזור לחקור את ההפצה המפורטת וארגון של אבות עצביים חיוביים SOX2 ביחס נוירונים חיוביים בטא-3 טובולין. אורגנוידים במוח היו מוכתמים עבור סמנים ספציפיים למיטוכונדריה, כגון translocase של הממברנה החיצונית או TOM20.פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח בוצע על ידי מדידת חילוף החומרים המיטוכונדריאלי באמצעות קצב צריכת החמצן, או OCR, ואת חילוף החומרים הגליקוליטי באמצעות קצב החמצה חוץ תאית, או ECAR. אוליגומיצין גורם לירידה בפרופיל זיהוי האופטי (OCR) ולכן מזהה את זיהוי האופטי (OCR) הדרוש לייצור ATP. על טיפול אוליגומיצין, ייתכן גם עלייה מפצה ECAR מציע כי התאים יכולים upregulate גליקוליזה כדי למנוע את הלחץ המטבולי.בעת העברת הנוירוספרות מהצלחת 96-באר ללוח תרבות או במהלך הליך התיקון, חשוב לטפל באורגנוידים בעדינות כדי למנוע פגיעה בהם. בעקבות הדור של organoids המוח, מערך רב אלקטרודה או הדמיית סידן יהיה שיטות אידיאליות כדי לבדוק את הפונקציונליות של organoids.

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

Abstract