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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire et la caractérisation ultérieure de sous-ensembles cellulaires sur des plateformes cytométriques en flux standard.

Résumé

Les expectorations, largement utilisées pour étudier le contenu cellulaire et d’autres caractéristiques microenvironnementales afin de comprendre la santé du poumon, sont traditionnellement analysées à l’aide de méthodologies cytologiques. Son utilité est limitée car la lecture des diapositives prend beaucoup de temps et nécessite un personnel hautement spécialisé. De plus, des débris étendus et la présence d’un trop grand nombre de cellules épithéliales squameuses (ETC), ou cellules des joues, rendent souvent un échantillon inadéquat pour le diagnostic. En revanche, la cytométrie en flux permet un phénotypage à haut débit des populations cellulaires tout en excluant simultanément les débris et les SEC.

Le protocole présenté ici décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire, tacher les anticorps et fixer les populations cellulaires, et acquérir des échantillons sur une plate-forme cytométrique en flux. Une stratégie de contrôle qui décrit l’exclusion des débris, des cellules mortes (y compris les SEC) et des doublets cellulaires est présentée ici. En outre, ce travail explique également comment analyser des cellules d’expectorations uniques viables basées sur un groupe de populations positives et négatives de différenciation (CD)45 pour caractériser des sous-ensembles de lignées hématopoïétiques et épithéliales. Une mesure de contrôle de la qualité est également fournie en identifiant les macrophages spécifiques aux poumons comme preuve qu’un échantillon est dérivé du poumon et n’est pas de la salive. Enfin, il a été démontré que cette méthode peut être appliquée à différentes plateformes cytométriques en fournissant des profils d’expectorations du même patient analysés sur trois cytomètres de flux; Navios EX, LSR II et Lyric. De plus, ce protocole peut être modifié pour inclure des marqueurs cellulaires supplémentaires d’intérêt. Une méthode d’analyse d’un échantillon d’expectorations entier sur une plate-forme cytométrique en flux est présentée ici qui rend les expectorations utilisables pour le développement de diagnostics à haut débit des maladies pulmonaires.

Introduction

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8. Bien que la plupart des cellules des expectorations soient d’origine hématopoïétique9,10,11, la cytométrie en flux n’a pas été largement appliquée à l’analyse des expectorations à des fins diagnostiques. Cependant, plusieurs études suggèrent que l’évaluation des populations de cellules immunitaires dans les expectorations (le sous-ensemble de cellules le plus important) peut être d’une grande aide dans le diagnostic et / ou la surveillance de maladies telles que l’asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC)12,13,14,15. De plus, l’existence de marqueurs épithéliaux spécifiques qui peuvent être utilisés en cytométrie en flux permet l’interrogation du sous-ensemble de cellules le plus important suivant dans les expectorations, les cellules épithéliales pulmonaires.

En plus de la capacité d’analyser de nombreuses populations cellulaires distinctes d’origines tissulaires différentes, un cytomètre en flux peut évaluer un grand nombre de cellules dans une période relativement courte. En comparaison, les types d’analyses cytologiques à base de lames nécessitent souvent du personnel et/ou de l’équipement hautement spécialisés. Ces analyses peuvent nécessiter beaucoup de main-d’œuvre, ce qui conduit à l’analyse d’une partie seulement de l’échantillon d’expectorations16.

Trois problèmes critiques limitent l’utilisation généralisée des expectorations en cytométrie en flux. La première question concerne la collecte des expectorations. Les expectorations sont recueillies par une toux qui expulse le mucus des poumons dans la cavité buccale, puis crache dans une tasse de collecte. Étant donné que le mucus se déplace à travers la cavité buccale, il y a un risque élevé de contamination par la SEC. Cette contamination complique l’analyse de l’échantillon, mais le problème est facilement rectifié sur une plate-forme cytométrique en flux, comme le montre cette étude.

Tout le monde ne peut pas produire des expectorations spontanément; par conséquent, plusieurs dispositifs ont été mis au point pour faciliter la collecte des expectorations de manière non invasive17. Le nébuliseur est l’un de ces dispositifs et il a été démontré qu’il produisait des échantillons d’expectorations fiables18,19,20. Bien que le nébuliseur soit un moyen très efficace de collecter les expectorations de manière non invasive, son utilisation nécessite toujours un réglage dans un établissement médical avec du personnel spécialisé21. En revanche, les appareils portatifs tels que la flûte pulmonaire22,23,24 et l’acapella16,25 peuvent être utilisés à la maison car ils sont très conviviaux. Ces dispositifs d’assistance sont à la fois sûrs et rentables.

Pour nous, l’acapella a toujours donné de meilleurs résultats que la flûte pulmonaire16, et par conséquent, le dispositif acapella a été choisi pour les collections d’expectorations. Un échantillon de prélèvement de 3 jours a été décidé parce que le but principal de l’utilisation des expectorations est de développer un test de détection du cancer du poumon16. Il a été démontré qu’un échantillon de 3 jours augmente la probabilité de détection du cancer du poumon par rapport à un échantillon de 1 ou 2 jours26,27,28. Cependant, d’autres méthodes de collecte des expectorations peuvent être préférables à des fins différentes. Si une méthode de collecte des expectorations différente de celle décrite ici est utilisée, il est recommandé de titrer soigneusement chaque anticorps ou colorant utilisé pour l’analyse cytométrique en flux; très peu de données sont disponibles sur la façon dont les différentes méthodes de collecte des expectorations affectent les protéines ciblées pour la cytométrie en flux.

Le deuxième problème qui atténue l’enthousiasme pour l’utilisation des expectorations pour le diagnostic, principalement lié à la cytométrie en flux, est le nombre de cellules. Le problème est la collecte de suffisamment de cellules viables pour une analyse fiable. Deux études ont démontré que les échantillons d’expectorations prélevés par des méthodes non invasives, à l’aide d’un dispositif d’assistance, contiennent suffisamment de cellules viables pouvant être utilisées dans le diagnostic clinique ou les études de recherche16,24. Cependant, aucune de ces études n’a abordé la question du nombre de cellules concernant la cytométrie en flux.

Pour les études qui constituent la base de ce protocole, des échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des participants à risque élevé de développer un cancer du poumon conformément aux directives institutionnelles approuvées pour chaque site d’étude. Les participants à risque élevé ont été définis comme étant âgés de 55 à 75 ans, ayant fumé 30 paquets-années et n’ayant pas cessé de fumer au cours des 15 dernières années. On a montré aux patients comment utiliser le dispositif acapella conformément aux instructions du fabricant29 et ont recueilli des expectorations pendant trois jours consécutifs à la maison. L’échantillon a été conservé au réfrigérateur jusqu’à la dernière collecte. Le dernier jour du prélèvement, l’échantillon a été expédié au laboratoire pendant la nuit avec un compresse froid congelé. Les échantillons ont été transformés en une suspension à cellule unique le jour de leur réception. Avec cette méthode de collecte des expectorations, on obtient plus qu’assez de cellules viables pour une analyse cytométrique en flux fiable.

Enfin, et en relation avec le problème précédent du nombre de cellules, il y a la question de savoir comment libérer les cellules des expectorations de leur environnement mucineux. Comment les cellules peuvent-elles rester viables et créer une suspension cellulaire unique qui n’obstrue pas le cytomètre en flux? Basé sur les travaux initiaux de Pizzichini et al.30 et Miller et al.31, ce protocole décrit une méthode facile et fiable pour le traitement des expectorations en une suspension à cellule unique qui convient à l’analyse cytométrique en flux. Cette méthode a utilisé des lignes directrices bien établies en cytométrie en flux32,33,34 pour développer une stratégie efficace de marquage des anticorps afin d’identifier les cellules hématopoïétiques et épithéliales dans les expectorations et de fournir des paramètres d’instrument, des mesures de contrôle de la qualité et des lignes directrices d’analyse normalisant l’analyse des expectorations sur une plate-forme cytométrique en flux.

Protocole

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations

  1. Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation.
    ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément aux instructions du fabricant et congeler à -20 °C dans des aliquotes de 25 mL jusqu’à utilisation.
  2. Approximer le poids de l’échantillon et décongeler suffisamment 0,1 % de dithiothréitol (TNT) pour l’étape 2.2 et l’amener à 37 °C. (Les aliquotes de TNT doivent être conservées à -20 °C avant utilisation.)
  3. Apportez suffisamment de 0,5 % de N-acétyl-L-cystéine (NAC) jusqu’à 37 °C pour l’étape 2.2. (Le NAC doit être préparé frais chaque semaine et conservé à 4 °C avant utilisation.)

2. Dissociation des expectorations

  1. Peser l’échantillon d’expectorations pour déterminer les volumes de réactifs de dissociation.
    REMARQUE: Un échantillon est considéré comme petit si le poids initial est de ≤3 g, moyen s’il est >3 g mais ≤8 g, grand s’il >8 mais ≤16 g et extra-grand si un échantillon pèse >16 g. Les indications petite, moyenne, grande et extra-large seront utilisées tout au long du protocole. La quantité de réactifs nécessaires à la dissociation et au marquage diffère selon la taille de l’échantillon d’expectorations.
  2. Transférer un petit échantillon dans un tube conique propre de 50 mL, un échantillon moyen dans une bouteille jetable en plastique propre de 250 mL ou un échantillon grand et extra-large dans une bouteille jetable en plastique propre de 500 mL. Ajouter 1 mL/g de poids d’échantillon de 0,5 % de NAC et 4 mL/g de poids d’échantillon de 0,1 % de TNT.
  3. Vortex à vitesse maximale (pendant 15 s), puis roche à température ambiante (à vitesse maximale) pendant 15 min.
  4. Diluer l’échantillon avec quatre volumes de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) (en fonction du volume total de l’échantillon + réactifs) pour neutraliser le NAC et la TNT; vortex rapidement à vitesse maximale et roche à température ambiante pendant 5 min à vitesse maximale.
  5. Filtrer la suspension cellulaire à travers une ou plusieurs crépines de cellules en maille de nylon de 100 μm dans un ou plusieurs tubes de centrifugeuse coniques de 50 mL pour créer une suspension à cellule unique.
  6. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le surnageant, combiner toutes les pastilles dans un tube conique de 15 mL, puis laver les pastilles avec HBSS dans les mêmes conditions.
  7. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de tampon déterminé par le poids initial de l’échantillon d’expectorations.
    REMARQUE : Un petit échantillon est remis en suspension dans 250 μL de HBSS. Un échantillon moyen est remis en suspension dans 760 μL de HBSS. Les échantillons de grande taille et de très grande taille sont remis en suspension dans 1460 μL de HBSS.
  8. Prenez une aliquote de la suspension cellulaire pour un comptage de cellules vivantes / mortes en utilisant Trypan Blue.
    REMARQUE: Pour un petit échantillon, utilisez 5 μL. Pour un échantillon moyen, grand ou extra-large, utilisez 10 μL. Diluer 1:10 avec HBSS.
    1. Mélanger 10 μL de dilution des expectorations avec 30 μL de 0,4 % de bleu de trypan pour obtenir une dilution finale de l’échantillon de 1:40. Chargez dans les chambres de comptage d’un hémocytomètre pour un comptage cellulaire.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire d’ajuster la dilution finale si le nombre de cellules est trop faible ou trop élevé pour obtenir un nombre précis. Il est fortement recommandé de consulter Guiot et al.20 pour distinguer correctement les cellules d’expectorations des SEC et des débris. Ceci est essentiel pour un comptage précis des cellules.
  9. De l’échantillon extra-large, retirez 50 x 106 cellules du total et ajoutez-les à un nouveau tube avec suffisamment de HBSS ajouté pour créer un volume total de 1700 μL.
    REMARQUE : Considérez qu’il s’agit d’un échantillon volumineux pour le reste du protocole. Les échantillons restants peuvent être jetés ou utilisés à d’autres fins.

3. Coloration des anticorps et des colorants de viabilité

  1. Choix de l’anticorps et du colorant
    NOTE : Le tableau 1 montre les anticorps et le colorant de viabilité utilisés dans ce protocole et les populations cellulaires qu’ils identifient.
    1. Étiqueter les tubes contenant les cellules d’expectorations (voir le tableau 2 pour les étiquettes).
    2. Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL (compatibles avec le cytomètre en flux utilisé) pour le tube d’échantillon avec les cellules non colorées et le tube avec le contrôle d’isotype. Utilisez des tubes coniques de 15 mL pour les échantillons de sang et de tubes épithéliaux.
      REMARQUE: Ces échantillons seront transférés dans des tubes de cytométrie en flux après la coloration et la fixation des anticorps.
  2. Étiquetez les tubes de compensation (tableau 3).
    REMARQUE: Utilisez des tubes de cytométrie en flux de 5 mL compatibles avec le cytomètre en flux utilisé.
  3. Ajouter la quantité d’HBSS, d’anticorps et/ou de colorant à chacun des tubes cellulaires d’expectorations et des tubes de compensation comme indiqué dans les tableaux 2 et 3, respectivement.
    REMARQUE: Ajoutez un tampon (HBBS), des anticorps et un colorant à tous les tubes avant d’ajouter des cellules ou des perles de compensation pour vous assurer que le temps de coloration de tous les tubes est cohérent.
  4. Ajouter les quantités de volume de cellules d’expectorations indiquées dans le tableau 2 aux tubes d’essai.
  5. Ajoutez des perles de compensation aux tubes de compensation comme indiqué dans le tableau 3.
  6. Incuber tous les tubes (tubes d’essai et de compensation) sur de la glace, à l’abri de la lumière, pendant 35 min. Ensuite, remplissez les tubes avec du HBSS glacé et centrifugez à 4 °C pendant 10 min à 800 x g.
  7. Pour les tubes de compensation, aspirez le surnageant aussi près que possible des pastilles et faites glisser les pastilles pour les desserrer.
  8. Ajouter 0,5 mL de HBSS froid aux tubes de compensation, les stocker sur la glace à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’analyse par cytométrie en flux.
  9. Aspirer le surnageant de l’isotype, du sang et des tubes épithéliaux non colorés après la centrifugation (étape 3.6 de la section de coloration des anticorps) et desserrer les pastilles en agitant les tubes.

4. Fixation avec 1% de paraformaldéhyde (PFA)

  1. Ajouter du PFA froid de 1 % (qui devrait être décongelé maintenant) aux tubes non colorés, isotypes, sanguins et épithéliaux; 2 mL aux tubes non colorés et isotypes, et 10 mL aux tubes sanguins et épithéliaux.
  2. Incuber les tubes sur de la glace, à l’abri de la lumière pendant 1 h. Vortex rapidement à vitesse maximale après 30 min.
  3. Remplissez les tubes avec du HBSS glacé. Ensuite, centrifugez les tubes à 4 °C pendant 10 min à 1600 x g.
  4. Aspirer autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire et faire glisser le tube avec les doigts pour desserrer les cellules.
  5. Ajouter 200 μL de HBSS froid aux tubes non colorés et isotypes.
  6. Calculer le volume d’HBSS pour la remise en suspension du sang et du tube épithélial en fonction du nombre total de cellules.
    REMARQUE: Volume de remise en suspension = 0,15 x [nombre total de cellules (étape 8 de la dissociation des expectorations) / 106]. Utilisez 50 x 106 comme nombre de cellules pour un échantillon extra-large.
  7. Conservez tous les tubes d’échantillonnage et de compensation, à l’abri de la lumière sur la glace à 4 °C jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux soit effectuée.
    REMARQUE: Ce protocole n’a pas été testé pour le stockage depuis plus de 24 heures.

5. Acquisition de données sur le cytomètre en flux

  1. Appliquer les procédures de démarrage appropriées pour le cytomètre en flux utilisé.
    REMARQUE: Cette section du protocole suppose que la personne qui utilise le cytomètre en flux est formée à l’utilisation de l’instrument à sa disposition, en particulier en ce qui concerne les procédures quotidiennes, y compris la vérification de la stabilité des systèmes optiques et fluidiques, les techniques de normalisation de la diffusion de la lumière et de l’intensité de fluorescence, ainsi que le calcul et l’application de la matrice de compensation correcte.
  2. Utilisez le mélange de billes du National Institute of Standards and Technology (NIST) pour vous assurer que les tensions de diffusion vers l’avant et de diffusion latérale sont réglées pour placer les billes NIST afin de couvrir toute la parcelle sans placer les perles trop près des axes.
    REMARQUE: Cette étape est cruciale pour s’assurer que les débris de moins de 5 μm peuvent être éliminés par une analyse post-acquisition de contrôle. Selon le cytomètre de flux utilisé, gardez à l’esprit que les plus petites billes ne sont pas exclues avec le seuil (lors de l’utilisation du LSR II ou du Lyric) ou avec le discriminateur élevé (en utilisant le cytomètre de flux Navios EX). Pour le Navios EX, un gain de 2 a été utilisé pour la diffusion avant et latérale, une tension de 236 pour la diffusion avant et de 250 pour la diffusion latérale. Pour le LSR II, une tension de diffusion directe de 165 et une tension de diffusion latérale de 190 ont été utilisées.
  3. Réglez le débit sur moyen (LSR II) ou élevé (Navios EX).
    REMARQUE: Le débit moyen ou élevé de la plupart des instruments peut être utilisé pour acquérir les tubes d’expectorations. Il est important de noter que l’utilisation d’un débit trop lent ou trop dilué de l’échantillon peut entraîner la sédimentation des cellules, entraînant une augmentation du vortex qui n’est pas souhaitée. Par conséquent, le respect du volume de remise en suspension calculé à l’étape 4.6 devrait entraîner une densité cellulaire qui peut être acquise rapidement mais ne pas obstruer la machine.
  4. Ajustez les tensions pour chaque paramètre utilisé pour les paramètres de diffusion et de fluorescence afin de placer les populations cellulaires sur l’échelle. Utilisez les chiffres avec la stratégie de contrôle comme guide sur la façon d’ajuster les tensions en conséquence.
    Remarque : Assurez-vous que tous les paramètres nécessaires sont sélectionnés dans la fenêtre de sélection des paramètres avant l’acquisition ou que les données ne seront pas acquises.
  5. Obtenez d’abord des données pour l’échantillon d’expectorations non coloré, suivi de l’échantillon coloré par isotype, puis du tube sanguin et du tube épithélial.
    REMARQUE: Si la suspension cellulaire est trop concentrée pour permettre au cytomètre en flux de faire fonctionner les échantillons sans obstruer, les échantillons peuvent être dilués avec HBSS.

Résultats

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans p...

Discussion

Le contenu cellulaire des expectorations comprend une grande variété de cellules très variées, souvent accompagnées de beaucoup de débris37. De plus, l’analyse des expectorations nécessite un contrôle de la qualité qui confirme que l’échantillon est prélevé dans les poumons au lieu de la cavité buccale38. Par conséquent, il n’est pas aussi simple d’analyser les expectorations par cytométrie en flux que pour le sang, par exemple, qui libère une suspen...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs sont des employés passés ou actuels de bioAffinity Technologies.

Remerciements

Nous tenons à remercier David Rodriguez pour son aide dans la préparation de la figure. Des échantillons d’expectorations ont été exécutés sur le BD LSR II à l’UT Health San Antonio Flow Cytometry Shared Resource Facility, soutenu par UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC à UT Health) et UL1 TR001120 (subvention CTSA).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

Références

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nature Reviews. Immunology. 4 (8), 648-655 (2004).
  3. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  4. Robinson, J. P., Roederer, M. History of science. Flow cytometry strikes gold. Science. 350 (6262), 739-740 (2015).
  5. Orfao, A., et al. Immunophenotypic dissection of normal hematopoiesis. Journal of Immunological Methods. 475, 112684 (2019).
  6. Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
  7. Bento, L. C., et al. The use of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: A review. Frontiers in Oncology. 7, 270 (2017).
  8. Della Porta, M. G., Picone, C. Diagnostic utility of flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases. 9 (1), 2017017 (2017).
  9. Belda, J., et al. Induced sputum cell counts in healthy adults. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2), 475-478 (2000).
  10. Spanevello, A., et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 162 (3), 1172-1174 (2000).
  11. Thomas, R. A., et al. The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects. Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).
  12. Hastie, A. T., et al. Mixed sputum granulocyte longitudinal impact on lung function in the severe asthma research program. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (7), 882-892 (2021).
  13. Hastie, A. T., et al. Association of sputum and blood eosinophil concentrations with clinical measures of COPD severity: an analysis of the SPIROMICS cohort. The Lancet. Respiratory Medicine. 5 (12), 956-967 (2017).
  14. Kim, J., et al. Innate immune crosstalk in asthmatic airways: Innate lymphoid cells coordinate polarization of lung macrophages. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (5), 1769-1782 (2019).
  15. Bai, Y., Zhou, Q., Fang, Q., Song, L., Chen, K. Inflammatory cytokines and T-Lymphocyte subsets in serum and sputum in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 25, 2206-2210 (2019).
  16. Patriquin, L., et al. Early detection of lung cancer with meso tetra (4-Carboxyphenyl) porphyrin-labeled sputum. Journal of Thoracic Oncology. 10 (9), 1311-1318 (2015).
  17. Hristara-Papadopoulou, A., Tsanakas, J., Diomou, G., Papadopoulou, O. Current devices of respiratory physiotherapy. Hippokratia. 12 (4), 211-220 (2008).
  18. Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. Cellular and biochemical analysis of induced sputum from asthmatic and from healthy subjects. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).
  19. Alexis, N., Soukup, J., Ghio, A., Becker, S. Sputum phagocytes from healthy individuals are functional and activated: a flow cytometric comparison with cells in bronchoalveolar lavage and peripheral blood. Clinical Immunology. 97 (1), 21-32 (2000).
  20. Guiot, J., et al. Methodology for sputum induction and laboratory processing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56612 (2017).
  21. Paggiaro, P. L., et al. Sputum induction. The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 3-8 (2002).
  22. Anjuman, N., Li, N., Guarnera, M., Stass, S. A., Jiang, F. Evaluation of lung flute in sputum samples for molecular analysis of lung cancer. Clinical and Translational Medicine. 2, 15 (2013).
  23. Sethi, S., Yin, J., Anderson, P. K. Lung flute improves symptoms and health status in COPD with chronic bronchitis: A 26 week randomized controlled trial. Clinical and Translational Medicine. 3, 29 (2014).
  24. Su, J., et al. Analysis of lung flute-collected sputum for lung cancer diagnosis. Biomarker Insights. 10, 55-61 (2015).
  25. Naraparaju, S., Vaishali, K., Venkatesan, P., Acharya, V. A comparison of the Acapella and a threshold inspiratory muscle trainer for sputum clearance in bronchiectasis-A pilot study. Physiotherapy Theory and Practice. 26 (6), 353-357 (2010).
  26. Hinson, K. F., Kuper, S. W. The diagnosis of lung cancer by examination of sputum. Thorax. 18, 350-353 (1963).
  27. Johnston, W. W., Bossen, E. H. Ten years of respiratory cytopathology at Duke University Medical Center. I. The cytopathologic diagnosis of lung cancer during the years 1970 to 1974, noting the significance of specimen number and type. Acta Cytologica. 25 (2), 103-107 (1981).
  28. Ng, A. B., Horak, G. C. Factors significant in the diagnostic accuracy of lung cytology in bronchial washing and sputum samples. II. Sputum samples. Acta Cytologica. 27 (4), 397-402 (1983).
  29. . Smiths Medical Videos Available from: https://videos.smiths-medical.com/search?q=acapella&page=1 (2021)
  30. Pizzichini, E., et al. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid-phase measurements. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 154 (2), 308-317 (1996).
  31. Miller, H. R., Phipps, P. H., Rossier, E. Reduction of nonspecific fluorescence in respiratory specimens by pretreatment with N-acetylcysteine. Journal of Clinical Microbiology. 24 (3), 470-471 (1986).
  32. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  33. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  34. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
  35. Stewart, C. C., Stewart, S. J. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. , (2001).
  36. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  37. Kini, S. R. . Color Atlas of Pulmonary Cytopathology. , (2002).
  38. Papanicolaou Society of Cytopathology Task Force on Standards of Practice. Guidelines of the Papanicolaou Society of Cytopathology for the examination of cytologic specimens obtained from the respiratory tract. Diagnostic Cytopathology. 21 (1), 61-69 (1999).
  39. Holmes, K. L., et al. International Society for the Advancement of Cytometry cell sorter biosafety standards. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 85 (5), 434-453 (2014).
  40. Datta, S., Shah, L., Gilman, R. H., Evans, C. A. Comparison of sputum collection methods for tuberculosis diagnosis: a systematic review and pairwise and network meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (8), 760-771 (2017).
  41. Armstrong-Hough, M., et al. "Something so hard": a mixed-methods study of home sputum collection for tuberculosis contact investigation in Uganda. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease: The Official Journal of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. 22 (10), 1152-1159 (2018).
  42. Freeman, C. M., et al. Design of a multi-center immunophenotyping analysis of peripheral blood, sputum and bronchoalveolar lavage fluid in the Subpopulations and Intermediate Outcome Measures in COPD Study (SPIROMICS). Journal of Translational Medicine. 13, 19 (2015).
  43. Petsky, H. L., Li, A., Chang, A. B. Tailored interventions based on sputum eosinophils versus clinical symptoms for asthma in children and adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 8, 005603 (2017).
  44. Hisert, K. B., Liles, W. C., Manicone, A. M. A flow cytometric method for isolating cystic fibrosis airway macrophages from expectorated sputum. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (1), 42-50 (2019).
  45. Duncan, G. A., et al. Microstructural alterations of sputum in cystic fibrosis lung disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (18), 88198 (2016).
  46. Kemp, R. A., Reinders, D. M., Turic, B. Detection of lung cancer by automated sputum cytometry. Journal of Thoracic Oncology: Official Publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2 (11), 993-1000 (2007).
  47. Blandin Knight, S., et al. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open Biology. 7 (9), (2017).
  48. Gomperts, B. N., Spira, A., Elashoff, D. E., Dubinett, S. M. Lung cancer biomarkers: FISHing in the sputum for risk assessment and early detection. Cancer Prevention Research. 3 (4), 420-423 (2010).
  49. Demoruelle, M. K., et al. Antibody responses to citrullinated and noncitrullinated antigens in the sputum of subjects with rheumatoid arthritis and subjects at risk for development of rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (4), 516-527 (2018).
  50. Wang, K., et al. Differences of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 shedding duration in sputum and nasopharyngeal swab specimens among adult inpatients with coronavirus disease 2019. Chest. 158 (5), 1876-1884 (2020).
  51. Chattopadhyay, P. K., Hogerkorp, C. -. M., Roederer, M. A chromatic explosion: the development and future of multiparameter flow cytometry. Immunology. 125 (4), 441-449 (2008).
  52. Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nature Immunology. 15 (2), 128-135 (2014).
  53. Perfetto, S. P., et al. Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  54. Chattopadhyay, P. K., et al. Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine. 12 (8), 972-977 (2006).
  55. Duetz, C., Bachas, C., Westers, T. M., Avan de Loosdrecht, A. A. Computational analysis of flow cytometry data in hematological malignancies: future clinical practice. Current Opinion in Oncology. 32 (2), 162-169 (2020).
  56. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews. Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

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