Analyse des expectorations de qualité contrôlée par cytométrie en flux

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire et la caractérisation ultérieure de sous-ensembles cellulaires sur des plateformes cytométriques en flux standard.

Résumé

Les expectorations, largement utilisées pour étudier le contenu cellulaire et d’autres caractéristiques microenvironnementales afin de comprendre la santé du poumon, sont traditionnellement analysées à l’aide de méthodologies cytologiques. Son utilité est limitée car la lecture des diapositives prend beaucoup de temps et nécessite un personnel hautement spécialisé. De plus, des débris étendus et la présence d’un trop grand nombre de cellules épithéliales squameuses (ETC), ou cellules des joues, rendent souvent un échantillon inadéquat pour le diagnostic. En revanche, la cytométrie en flux permet un phénotypage à haut débit des populations cellulaires tout en excluant simultanément les débris et les SEC.

Le protocole présenté ici décrit une méthode efficace pour dissocier les expectorations en une seule suspension cellulaire, tacher les anticorps et fixer les populations cellulaires, et acquérir des échantillons sur une plate-forme cytométrique en flux. Une stratégie de contrôle qui décrit l’exclusion des débris, des cellules mortes (y compris les SEC) et des doublets cellulaires est présentée ici. En outre, ce travail explique également comment analyser des cellules d’expectorations uniques viables basées sur un groupe de populations positives et négatives de différenciation (CD)45 pour caractériser des sous-ensembles de lignées hématopoïétiques et épithéliales. Une mesure de contrôle de la qualité est également fournie en identifiant les macrophages spécifiques aux poumons comme preuve qu’un échantillon est dérivé du poumon et n’est pas de la salive. Enfin, il a été démontré que cette méthode peut être appliquée à différentes plateformes cytométriques en fournissant des profils d’expectorations du même patient analysés sur trois cytomètres de flux; Navios EX, LSR II et Lyric. De plus, ce protocole peut être modifié pour inclure des marqueurs cellulaires supplémentaires d’intérêt. Une méthode d’analyse d’un échantillon d’expectorations entier sur une plate-forme cytométrique en flux est présentée ici qui rend les expectorations utilisables pour le développement de diagnostics à haut débit des maladies pulmonaires.

Introduction

Les progrès techniques dans le matériel et les logiciels des cytomètres de flux ont permis d’identifier simultanément de nombreuses populations cellulaires distinctes1,2,3,4. L’utilisation du cytomètre en flux dans la recherche sur les cellules hématopoïétiques, par exemple, a permis de mieux comprendre le système ^immunitaire2 et la hiérarchie cellulaire du système hématopoïétique5, ainsi que la distinction diagnostique d’une multitude de cancers du sang différents6,7,8.....

Protocole

Toutes les étapes du traitement des expectorations sont effectuées dans une armoire de sécurité biologique avec l’équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation du réactif avant le début de la dissociation des expectorations

1. Décongeler 1 % de paraformaldéhyde (PFA), 25 mL par échantillon sur de la glace et garder au froid jusqu’à utilisation.
   ATTENTION : Le PFA est toxique par inhalation et par contact cutané. Préparer le fixateur conformément aux instructions du fabricant et congeler à -20 °C dans des aliquotes de 25 mL jusqu’à utilisation.
2. Approximer le poids de l’échantillon et décongeler suffisamm....

Résultats

Ce protocole a été élaboré en tenant compte d’un laboratoire clinique. Lors de l’élaboration du protocole, l’accent a été mis sur la simplicité, l’efficacité et la reproductibilité. Il a été constaté que l’étape la plus longue dans le traitement des expectorations était de compter les cellules. Par conséquent, le protocole est configuré de manière à ce que le traitement des expectorations et l’étiquetage des cellules puissent être effectués indépendamment du comptage des cellules sans p.......

Discussion

Le contenu cellulaire des expectorations comprend une grande variété de cellules très variées, souvent accompagnées de beaucoup de ^débris37. De plus, l’analyse des expectorations nécessite un contrôle de la qualité qui confirme que l’échantillon est prélevé dans les poumons au lieu de la cavité ^buccale38. Par conséquent, il n’est pas aussi simple d’analyser les expectorations par cytométrie en flux que pour le sang, par exemple, qui libère une suspen.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061