유동 세포측정에 의한 품질 제어 가래 분석

Summary

이 프로토콜은 가래를 단일 셀 서스펜션으로 분리하고 표준 흐름 세포 측정 플랫폼에서 셀룰러 하위 집합의 후속 특성화를 결합하는 효율적인 방법을 설명합니다.

Abstract

가래는 세포 함량 및 폐의 건강을 이해하기 위해 다른 미세 환경 적 특징을 연구하는 데 널리 사용되며, 전통적으로 세포학 기반 방법론을 사용하여 분석됩니다. 슬라이드를 읽는 데 시간이 많이 걸리며 고도로 전문화된 인력이 필요하기 때문에 유틸리티가 제한됩니다. 더욱이, 광범위한 파편과 너무 많은 편평상피 세포 (SEC) 또는 뺨 세포의 존재는 종종 진단을 위해 부적당한 견본을 렌더링합니다. 대조적으로, 유동 세포측정은 동시에 파편과 SEC를 제외하면서 세포 집단의 높은 처리량 phenotyping을 허용합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 현탁액, 항체 얼룩 및 세포 집단을 고치고, 유동 세포 측정 플랫폼에서 샘플을 획득하는 효율적인 방법을 설명합니다. 파편, 죽은 세포 (SE포함) 및 세포 이중제의 배제를 설명하는 게이팅 전략이 여기에 제시됩니다. 또한, 이 작품은 또한 조혈 및 상피 계보 하위 집합을 특성화하기 위해 분화(CD)45 양성 및 음수 집단의 클러스터를 기반으로 실행 가능한 단일 가래 세포를 분석하는 방법을 설명한다. 품질 관리 측정은 또한 견본이 폐에서 파생되고 타액이 아니라는 것을 기록으로 폐 특정 대식세포를 확인해서 제공됩니다. 마지막으로, 이 방법은 3개의 유동 세포계에서 분석된 동일한 환자에게서 가래 프로파일을 제공함으로써 상이한 세포측정 플랫폼에 적용될 수 있다는 것이 입증되었다; 나비오스 EX, LSR II 및 가사. 더욱이, 이 프로토콜은 관심의 추가 세포 마커를 포함하도록 수정될 수 있다. 유동 세포측정 플랫폼에서 전체 가래 샘플을 분석하는 방법이 여기에 제시되어 폐 질환의 고처리량 진단을 개발하기 위해 가래가 가능하도록 합니다.

Introduction

흐름 세포계의 하드웨어 및 소프트웨어의 기술적 발전으로 인해 많은 별개의 세포 집단을 동시에 식별할 수 있게 되었습니다1,2,3,4. 조혈 세포 연구에서 유동 세포계의 활용은 예를 들어, 면역 체계²및 조^혈계의 세포 계층 구조에 대한 훨씬 더 나은 이해를 주도하고 있으며, 다양한 혈액암의 진단 구별을 이끌어 냈다^6,7,8. 대부분의 가래 세포는 조혈 기원^9,10,11이지만, 유동 세포분석은 진단 목적을 위해 가래 분석에 널리 적용되지 않았습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 가래에 있는 면역 세포 인구의 평가 (세포의 가장 중요한 부분 집합)가 천식과 ....

Protocol

가래 처리의 모든 단계는 적절한 개인 보호 장비와 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.

1. 가래 해리를 시작하기 전에 시약 준비

1. 1% 파라포름알데히드(PFA), 얼음 샘플당 25mL를 해동하고, 사용할 때까지 차갑게 유지하십시오.
   주의: PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 유독합니다. 제조업체의 지시에 따라 고정을 준비하고 사용할 때까지 25 mL 알리코에서 -20 °C에서 동결?.......

Discussion

가래의 세포 함량은 광범위한 세포의 큰 다양성을 포함, 종종 파편을 많이 동반³⁷. 또한, 가래 분석은 구강 대신 폐로부터 채취되는 시료를 확인하는 품질 관리를 필요로한다³⁸. 따라서, 혈액, 예를 들어 훨씬 더 깨끗하고 균일한 세포 현탁액을 방출하는 혈액에 대한 것처럼 혈류 세포측정에 의해 가래를 분석하는 것은 간단하지 않다. 이 프로토콜은 이러한 모든 .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061