Kvalitetskontrollert sputumanalyse ved flowcytometri

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon og den påfølgende karakteriseringen av cellulære delsett på standard flow cytometriske plattformer.

Abstract

Sputum, som er mye brukt til å studere cellulært innhold og andre mikromiljøfunksjoner for å forstå lungens helse, analyseres tradisjonelt ved hjelp av cytologibaserte metoder. Verktøyet er begrenset fordi lesing av lysbildene er tidkrevende og krever høyt spesialisert personell. Videre gjør omfattende rusk og tilstedeværelsen av for mange squamous epitelceller (SECs), eller kinnceller, ofte en prøve utilstrekkelig for diagnose. I motsetning gir strømningscytometri mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping av cellulære populasjoner samtidig som rusk og SECer utelates.

Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon, antistoff flekk og fikse cellulære populasjoner, og skaffe prøver på en strømning cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver utelukkelse av rusk, døde celler (inkludert SECs) og celle dobler presenteres her. Videre forklarer dette arbeidet også hvordan man analyserer levedyktige, enkle sputumceller basert på en klynge av differensiering (CD) 45 positive og negative populasjoner for å karakterisere hematopoietiske og epiteliale avgrensningsundergrupper. Et kvalitetskontrolltiltak er også gitt ved å identifisere lungespesifikke makrofager som bevis på at en prøve er avledet fra lungen og ikke er spytt. Til slutt har det blitt demonstrert at denne metoden kan brukes på forskjellige cytometriske plattformer ved å gi sputumprofiler fra samme pasient analysert på tre strømningscytometere; Navios EX, LSR II og Lyric. Videre kan denne protokollen endres for å inkludere flere mobilmarkører av interesse. En metode for å analysere en hel sputumprøve på en strømningscytometrisk plattform presenteres her som gjør sputum egnet for å utvikle høygjennomstrømningsdiagnostikk av lungesykdom.

Introduction

Tekniske fremskritt innen maskinvare og programvare for flytcytometere har gjort det mulig å identifisere mange forskjellige cellepopulasjoner ^{samtidig1,2,3,4}. Utnyttelsen av strømningscytometeret i hematopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en mye bedre forståelse av ^{immunsystemet2} og det cellulære hierarkiet i det hematopoietiske ^systemet5, samt det diagnostiske skillet mellom en rekke forskjellige blodkreft6,7,8.

Protocol

Alle trinn i sputumbehandlingen utføres i et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr.

1. Reagensforberedelse før du starter sputum dissosiasjon

1. Tine 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prøve på is, og hold deg kald til bruk.
   FORSIKTIG: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Forbered fikseringsmiddelet i henhold til produsentens instruksjoner og frys ved -20 °C i 25 ml aliquots til bruk.
2. Omtrent vekten av prøven og tine nok 0,1% Dithiothreit.......

Discussion

Det cellulære innholdet av sputum inkluderer et stort utvalg av brede celler, ofte ledsaget av mye ^rusk37. I tillegg krever sputumanalyse en kvalitetskontroll som bekrefter at prøven samles inn fra lungen i stedet for ^munnhulen38. Derfor er det ikke så enkelt å analysere sputum ved strømningscytometri som det er for blod, for eksempel, som frigjør en mye renere og homogen cellefjæring. Denne protokollen har adressert alle disse problemene: å gi instrumentinnstilling.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061