تحليل البلغم الذي يتم التحكم فيه بالجودة حسب قياس التدفق الخلوي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعدم ربط البلغم بتعليق خلية واحدة والتوصيف اللاحق للمجموعات الفرعية الخلوية على منصات قياس التدفق الخلوي القياسية.

Abstract

يتم تحليل البلغم ، الذي يستخدم على نطاق واسع لدراسة المحتوى الخلوي والميزات الأخرى للبيئة الدقيقة لفهم صحة الرئة ، تقليديا باستخدام منهجيات قائمة على علم الخلايا. فائدته محدودة لأن قراءة الشرائح تستغرق وقتا طويلا وتتطلب موظفين متخصصين للغاية. وعلاوة على ذلك، فإن الحطام الواسع النطاق ووجود عدد كبير جدا من الخلايا الظهارية الحرشفية ، أو خلايا الخد ، غالبا ما يجعل العينة غير كافية للتشخيص. وعلى النقيض من ذلك، يسمح قياس التدفق الخلوي بطباعة الخلايا ذات الإنتاجية العالية مع استبعاد الحطام ومركبات الكربون المستدامة في نفس الوقت.

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة فعالة لتفكيك البلغم إلى تعليق خلية واحدة ، وصمة عار الأجسام المضادة وإصلاح المجموعات الخلوية ، والحصول على عينات على منصة قياس التدفق الخلوي. استراتيجية gating التي تصف استبعاد الحطام والخلايا الميتة (بما في ذلك الشركات الصغيرة والمتوسطة) ومزدوجات الخلية معروضة هنا. علاوة على ذلك ، يشرح هذا العمل أيضا كيفية تحليل خلايا البلغم الواحدة القابلة للتطبيق استنادا إلى مجموعة من التمايز (CD)45 مجموعات سكانية إيجابية وسلبية لتوصيف مجموعات فرعية من النسب الدموي والظهاري. كما يتم توفير مقياس لمراقبة الجودة من خلال تحديد الضامة الخاصة بالرئة كدليل على أن العينة مشتقة من الرئة وليست لعابا. وأخيرا، فقد ثبت أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على منصات مختلفة من خلال توفير ملامح البلغم من نفس المريض تحليلها على ثلاثة مقاييس تدفق الخلايا. نافيوس EX، LSR الثاني، ولريك. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل علامات خلوية إضافية ذات أهمية. يتم تقديم طريقة لتحليل عينة البلغم بأكملها على منصة قياس التدفق الخلوي هنا التي تجعل البلغم قابلا لتطوير تشخيص عالي الإنتاجية لمرض الرئة.

Introduction

وقد أتاحت التطورات التقنية في أجهزة وبرامج مقاييس التدفق الخلوي تحديد العديد من مجموعات الخلايا المتميزة في وقت ^{واحد1,2,3,4}. على سبيل المثال، أدى استخدام مقياس التدفق الخلوي في أبحاث الخلايا الدموية إلى فهم أفضل بكثير للجهاز ^{المناعي2} والتسلسل الهرمي الخلوي للنظام الدموي⁽⁵)، فضلا عن التمييز التشخيصي للعديد من أنواع سرطان الدم ^{المختلفة6,7,8}. على الرغم من أن معظم خلايا البلغم هي من أصل دموي9,10,11, لم يتم....

Protocol

يتم تنفيذ جميع خطوات معالجة البلغم في خزانة السلامة البيولوجية مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. إعداد الكاشف قبل البدء في تفكك البلغم

1. إذابة 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، 25 مل لكل عينة على الجليد، والحفاظ على البرد حتى الاستخدام.
   تنبيه: PFA سام عن طريق الاستنشاق والاتصا?.......

Discussion

يتضمن المحتوى الخلوي للسبيتوم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا واسعة النطاق ، غالبا ما يرافقها الكثير من ^{الحطام37}. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تحليل البلغم مراقبة الجودة التي تؤكد أن العينة يتم جمعها من الرئة بدلا من تجويف ^الفم38. لذلك ، فإنه ليس من السهل تحليل البلغم ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061