Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Abstract

Sputum, veel gebruikt om de cellulaire inhoud en andere micro-omgevingskenmerken te bestuderen om de gezondheid van de long te begrijpen, wordt traditioneel geanalyseerd met behulp van cytologie-gebaseerde methodologieën. Het nut ervan is beperkt omdat het lezen van de dia's tijdrovend is en zeer gespecialiseerd personeel vereist. Bovendien maakt uitgebreid puin en de aanwezigheid van te veel plaveiselepitheelcellen (SECs), of wangcellen, een monster vaak ongeschikt voor diagnose. Flowcytometrie daarentegen maakt fenotypering met hoge doorvoer van cellulaire populaties mogelijk, terwijl tegelijkertijd puin en SECs worden uitgesloten.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om sputum te dissociëren in een enkele celsuspensie, antilichaamkleuring en cellulaire populaties te fixeren en monsters te verkrijgen op een flowcytometrisch platform. Een gating-strategie die de uitsluiting van puin, dode cellen (inclusief SECs) en celdubbelts beschrijft, wordt hier gepresenteerd. Verder legt dit werk ook uit hoe levensvatbare, enkele sputumcellen kunnen worden geanalyseerd op basis van een cluster van differentiatie (CD)45 positieve en negatieve populaties om hematopoëtische en epitheliale afstammingssubsets te karakteriseren. Een kwaliteitscontrolemaatregel wordt ook geleverd door longspecifieke macrofagen te identificeren als bewijs dat een monster is afgeleid van de long en geen speeksel is. Ten slotte is aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op verschillende cytometrische platforms door sputumprofielen van dezelfde patiënt te verstrekken die op drie flowcytometers zijn geanalyseerd; Navios EX, LSR II en Lyric. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd om extra cellulaire markers van belang op te nemen. Een methode om een volledig sputummonster te analyseren op een flowcytometrisch platform wordt hier gepresenteerd dat sputum geschikt maakt voor het ontwikkelen van high-throughput diagnostiek van longziekte.

Introduction

Technische vooruitgang in de hardware en software van flowcytometers heeft het mogelijk gemaakt om veel verschillende celpopulaties tegelijkertijd te identificeren1,2,3,4. Het gebruik van de flowcytometer in hematopoëtisch celonderzoek heeft bijvoorbeeld geleid tot een veel beter begrip van het ^{immuunsysteem2} en de cellulaire hiërarchie van het hematopoëtische ^systeem5, evenals het diagnostische onderscheid van een veelheid aan verschillende bloedkankers6,7,8.....

Protocol

Alle stappen van de sputumverwerking worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.

1. Reagensvoorbereiding voordat met sputumdissociatie wordt begonnen

1. Ontdooi 1% paraformaldehyde (PFA), 25 ml per monster op ijs en houd koud tot gebruik.
   LET OP: PFA is giftig bij inademing en huidcontact. Bereid het fixeermiddel volgens de instructies van de fabrikant en vries het tot gebruik in bij -20 °C in 25 ml aliquots.
2. Benade.......

Discussion

De cellulaire inhoud van sputum omvat een grote verscheidenheid aan brede cellen, vaak vergezeld van veel ^puin37. Bovendien vereist sputumanalyse een kwaliteitscontrole die bevestigt dat het monster wordt verzameld uit de long in plaats van de ^mondholte38. Daarom is het niet zo eenvoudig om sputum te analyseren door flowcytometrie als voor bijvoorbeeld bloed, dat een veel schonere en homogene celsuspensie vrijgeeft. Dit protocol heeft al deze problemen aangepakt: het bieden.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061