ניתוח כיח מבוקר איכות לפי ציטומטריית זרימה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח למתלה תא בודד ואת האפיון הבא של תת-קבוצות סלולריות בפלטפורמות ציטומטריות סטנדרטיות של זרימה.

Abstract

כיח, בשימוש נרחב כדי ללמוד את התוכן התאי ותכונות מיקרו-ויברונמנטליות אחרות כדי להבין את בריאות הריאה, מנותח באופן מסורתי באמצעות מתודולוגיות מבוססות ציטולוגיה. השירות שלה מוגבל כי קריאת השקופיות גוזלת זמן רב ודורש כוח אדם מיוחד מאוד. יתר על כן, פסולת נרחבת ונוכחות של יותר מדי תאי אפיתל קשקשיים (SECs), או תאי הלחי, לעתים קרובות הופך מדגם לא מספיק לאבחון. לעומת זאת, ציטומטריית הזרימה מאפשרת פנוטיפינג בעל תפוקה גבוהה של אוכלוסיות הסלולר ובו זמנית למעט פסולת ו- SECs.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה יעילה לניתוק כיח לתוך מתלה תא יחיד, כתם נוגדנים ותיקון אוכלוסיות הסלולר, ולרכוש דגימות על פלטפורמה ציטומטרית זרימה. אסטרטגיית גטינג המתארת את הדרת הפסולת, תאים מתים (כולל SECs) ומכפילי תאים מוצגת כאן. יתר על כן, עבודה זו מסבירה גם כיצד לנתח תאי כיח יחיד קיימא המבוססים על אשכול של בידול (CD)45 אוכלוסיות חיוביות ושליליות כדי לאפיין תת-קבוצות שושלת hematopoietic ושושלת אפיתל. אמצעי בקרת איכות מסופק גם על ידי זיהוי מקרופאגים ספציפיים לריאות כראיה לכך שדגימה נגזרת מהריאה ואינה רוק. לבסוף, הוכח כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פלטפורמות ציטומטריות שונות על ידי מתן פרופילי כיח מאותו חולה שנותח על שלושה ציטומטרים זרימה; Navios EX, LSR II, וליריק. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי לכלול סמנים סלולריים נוספים של עניין. שיטה לניתוח דגימת כיח שלמה על פלטפורמה ציטומטרית זרימה מוצגת כאן מה שהופך את הליחה למקובלת לפיתוח אבחון בעל תפוקה גבוהה של מחלת ריאות.

Introduction

ההתקדמות הטכנית בחומרה ובתוכנה של ציטומטרי זרימה אפשרה לזהות אוכלוסיות תאים נפרדות רבות בו ^{זמנית1,2,3,4}. הניצול של cytometer הזרימה במחקר תאים hematopoietic, למשל, הוביל להבנה הרבה יותר טובה של המערכת ^{החיסונית2} ואת ההיררכיה התאית של המערכת hematopoietic5, כמו גם הבחנה אבחונית של שפע של סרטן דם שונים6,7,8. למרות שרוב תאי הכיח הם ממוצא hematopoietic9,10,11, ציטומטריית זרימה לא יושם באופן נרחב על ניתוח כי....

Protocol

כל שלבי עיבוד הכיח מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים.

1. הכנת ריאגנט לפני תחילת דיסוציאציה של כיח

1. מפשירים 1% Paraformaldehyde (PFA), 25 מ"ל לדגימה על קרח, ולשמור על קור עד השימוש.
   אזהרה: PFA רעיל על ידי שאיפה ומגע עור. הכן את הקיבעון על פי הוראות היצרן ולהקפיא ב -20 °C ב 2.......

Discussion

התוכן התאי של כיח כולל מגוון גדול של תאים רחבים, לעתים קרובות מלווה הרבה ^פסולת37. בנוסף, ניתוח כיח דורש בקרת איכות המאשרת את המדגם שנאסף מהריאה במקום מחלל ^הפה38. לכן, זה לא פשוט לנתח כיח על ידי ציטומטריה זרימה כפי שהוא עבור דם, למשל, אשר משחרר הרבה יותר נקי הומוגני השע?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061