फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता-नियंत्रित थूक विश्लेषण

Summary

यह प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन में थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है और मानक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर सेलुलर सबसेट के बाद के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।

Abstract

थूक, व्यापक रूप से फेफड़ों के स्वास्थ्य को समझने के लिए सेलुलर सामग्री और अन्य माइक्रोएनवायरमेंटल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, पारंपरिक रूप से साइटोलॉजी-आधारित तरीकों का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। इसकी उपयोगिता सीमित है क्योंकि स्लाइड पढ़ना समय लेने वाला है और इसके लिए अत्यधिक विशिष्ट कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, व्यापक मलबे और बहुत अधिक स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं (एसईसी), या गाल कोशिकाओं की उपस्थिति, अक्सर निदान के लिए अपर्याप्त नमूना प्रदान करती है। इसके विपरीत, फ्लो साइटोमेट्री सेलुलर आबादी के उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिंग के लिए अनुमति देता है, जबकि एक साथ मलबे और एसईसी को छोड़कर।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल सेल निलंबन, एंटीबॉडी दाग और सेलुलर आबादी को ठीक करने और एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म पर नमूने प्राप्त करने के लिए थूक को अलग करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है। एक गेटिंग रणनीति जो मलबे, मृत कोशिकाओं (एसईसी सहित) और सेल डबल्स के बहिष्करण का वर्णन करती है, यहां प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यह काम यह भी बताता है कि हेमटोपोइएटिक और उपकला वंश के सबसेट को चिह्नित करने के लिए भेदभाव (सीडी) 45 सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के एक समूह के आधार पर व्यवहार्य, एकल थूक कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए। एक गुणवत्ता नियंत्रण उपाय भी सबूत के रूप में फेफड़ों-विशिष्ट मैक्रोफेज की पहचान करके प्रदान किया जाता है कि एक नमूना फेफड़ों से प्राप्त होता है और लार नहीं होता है। अंत में, यह प्रदर्शित किया गया है कि इस विधि को तीन प्रवाह साइटोमीटर पर विश्लेषण किए गए एक ही रोगी से थूक प्रोफाइल प्रदान करके विभिन्न साइटोमेट्रिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है; Navios पूर्व, LSR द्वितीय, और गीत. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को ब्याज के अतिरिक्त सेलुलर मार्करों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक प्रवाह साइटोमेट्रिक प्लेटफ़ॉर्म पर एक पूरे थूक के नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक विधि यहां प्रस्तुत की गई है जो थूक को फेफड़ों की बीमारी के उच्च-थ्रूपुट निदान के विकास के लिए उपयुक्त बनाती है।

Introduction

प्रवाह साइटोमीटर के हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर में तकनीकी प्रगति ने एक साथ कई अलग-अलग सेल आबादी की पहचान करना संभव बना दिया ^{है1,2,3,4}। हेमटोपोइएटिक सेल अनुसंधान में प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग, उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रणाली ² और हेमटोपोइएटिक सिस्टम ⁵ के सेलुलर पदानुक्रम की बेहतर समझ के साथ-साथ विभिन्न रक्त कैंसर की भीड़ के नैदानिक अंतर को जन्म दिया ^है6,7,8। यद्यपि अधिकांश थूक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक मूल

Protocol

थूक प्रसंस्करण के सभी चरणों को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणके साथ एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।

1. थूक पृथक्करण शुरू करने से पहले अभिकर्मक तैयारी

1. 1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफ.......

Discussion

थूक की सेलुलर सामग्री में व्यापक कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता शामिल है, जो अक्सर बहुत सारे मलबे के साथ ^{होती है37}। इसके अलावा, थूक विश्लेषण के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण की आवश्यकता होती है जो पुष्ट.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061