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この記事について

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  • 転載および許可

要約

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

要約

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。

ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

概要

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に1,2,3,4個同定することが可能になりました例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系2および造血系5の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別6,7,8導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)12,13,14,15<....

プロトコル

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。

1. 痰解離開始前の試薬製剤

  1. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。
    注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°Cで凍結します。
  2. サンプルの重量に近いし、ステップ2.2のために十分な0.1%ジチオトレイトール(DTT)を解凍し、37°Cに持って来ます。 (DTTのアリコートは使用前に-20 °Cで保存する必要があります。
  3. ステップ2.2のために37 °Cまで十分な0.5%N-アセチル-L-システイン(NAC)を持って来なさい。(NACは毎週新鮮にして、使用前に4°Cで保管してください。

2. 痰解離

  1. 痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。
    注: サンプルは、最初のウェイトが ≤3 g、>3 g が ≤8 g の場合は中程度、>が 16 g ≤ 場合は大きい、サンプルが >16 g の場合は特大である場合は小さいと見なされます。小、中、大、および超大の表示は、プロトコル全体で使用されます。解離や標識に必要な試薬の量は、痰サンプルの大きさによって異なります。

結果

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられ?.......

ディスカッション

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片37を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔38の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。.......

開示事項

著者は全員、バイオアフィニティ・テクノロジーズの過去または現在の従業員です。

謝辞

ダビド・ロドリゲスのフィギュア準備に対する彼の支援に感謝したいと思います。痰サンプルは、UTヘルス、NIH-NCI P30 CA054174-20(UTヘルスのCTRC)およびUL1 TR001120(CTSA助成金)によってサポートされているUTヘルスサンアントニオフローサイトメトリー共有リソース施設のBD LSR IIで実行されました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1% Paraformaldehyde Flow-FixPolysciences25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL conical falcon tubeFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-human CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-human CD3BioLegend300415
Alexa488 anti-human cytokeratinBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 IsotypeBioLegend400129
BV510 anti-human CD45BioLegend304036
CD66b FITC isotypeBD Biosciences555748
CompBead Plus Compensation BeadsBD Biosciences560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS&T beadsBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-human CD66bGeneTexGTX75907
Fixable Viability StainBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Beads, 05 μMPolysciences64080
NIST Beads, 20 μMPolysciences64160
NIST Beads, 30 μMPolysciences64170
PE anti-human CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-human EpCAMBD Biosciences565399
PE-CF594 CD206/EpCAM IsotypeBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-human CD206BD Biosciences564063
Sodium citrate dihydrateEMDSX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%Fisher Scientific15250061

参考文献

  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M.

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