Kvalitetsstyrd Sputumanalys efter flödescytometri

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension och efterföljande karakterisering av cellulära delmängder på standard flöde cytometriska plattformar.

Abstract

Sputum, som ofta används för att studera cellulärt innehåll och andra mikromiljöfunktioner för att förstå lungans hälsa, analyseras traditionellt med hjälp av cytologibaserade metoder. Dess användbarhet är begränsad eftersom läsning av bilderna är tidskrävande och kräver högspecialiserad personal. Dessutom gör omfattande skräp och förekomsten av alltför många skivepitelceller (SECs), eller kindceller, ofta ett prov otillräckligt för diagnos. Däremot möjliggör flödescytometri fenotypning med hög genomströmning av cellulära populationer samtidigt som skräp och SEC exkluderas.

Protokollet som presenteras här beskriver en effektiv metod för att dissociera sputum i en enda cell suspension, antikroppsfläck och fixa cellulära populationer, och förvärva prover på en flöde cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver uteslutandet av skräp, döda celler (inklusive SECs) och celldubbel presenteras här. Vidare förklarar detta arbete också hur man analyserar livskraftiga, enstaka sputumceller baserat på ett kluster av differentiering (CD)45 positiva och negativa populationer för att karakterisera hematopoetiska och epitelial härstamning undergrupper. En kvalitetskontrollåtgärd tillhandahålls också genom att identifiera lungspecifika makrofager som bevis för att ett prov härrör från lungan och inte är saliv. Slutligen har det visats att denna metod kan tillämpas på olika cytometriska plattformar genom att tillhandahålla sputum profiler från samma patient analyseras på tre flöde cytometer. Navios EX, LSR II och Lyric. Dessutom kan detta protokoll ändras för att inkludera ytterligare cellulära markörer av intresse. En metod för att analysera ett helt sputumprov på en flöde cytometrisk plattform presenteras här som gör sputum mottaglig för att utveckla hög genomströmning diagnostik av lungsjukdom.

Introduction

Tekniska framsteg inom hårdvara och programvara för flödescytometrar har gjort det möjligt att identifiera många distinkta cellpopulationer samtidigt1,2,3,4. Användningen av flödescytometern i hematopoetisk cellforskning har till exempel lett till en mycket bättre förståelse för ^{immunsystemet2} och den cellulära hierarkin i det hematopoetiska ^systemet5, liksom den diagnostiska skillnaden mellan en mängd olika blodcancer6,7,8.<....

Protocol

Alla steg i sputumbehandlingen utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.

1. Reagensberedning innan sputumdissociation påbörjas

1. Tina 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prov på is och håll dig kall tills den används.
   VARNING: PFA är giftigt vid inandning och hudkontakt. Förbered fixativet enligt tillverkarens instruktioner och frys vid -20 °C i 25 ml alikvoter tills de används.
2. Approximera provets vikt och tina tillräcklig.......

Discussion

Det cellulära innehållet i sputum innehåller ett stort antal omfattande celler, ofta åtföljda av mycket ^skräp37. Dessutom kräver sputumanalys en kvalitetskontroll som bekräftar att provet samlas in från lungan istället för ^munhålan38. Därför är det inte lika enkelt att analysera sputum efter flödescytometri som det är för blod, till exempel, vilket frigör en mycket renare och homogen cellupphängning. Detta protokoll har tagit itu med alla dessa problem: .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061