Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Summary

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Abstract

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.

Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Introduction

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol ^{açmıştır2} ve hematopoetik sistemin hücresel ^{hiyerarşisi5}, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ^{ayrımı6,7,8}. Balgam ....

Protocol

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama

1. %1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun.
   DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.
2. Numunenin ağ.......

Discussion

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler ^içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü ^gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en k.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061