מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

Summary

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

Abstract

פרופיל קומפלקס העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלי (ETC) משתנה ברקמת הלב של הצאצא שנולד לזרועה מאומתנת. ההשערה שהוצעה ונבדקה הייתה שתרגיל אימהי קבוע של זריעה במהלך ההריון יגביר את היעילות המיטוכונדריאלית של ביו-אנרגטיקה של לב צאצאים. השערה זו נבדקה על ידי בידוד המיטוכונדריה באמצעות הליך בידוד מתון להערכת פרופילים מיטוכונדריאלי ETC וסופר-קומפלקס. ההליך המתואר כאן אפשר עיבוד של רקמות לב שהוקפאו בעבר בארכיון וביטל את הצורך בהכנת מיטוכונדריה טרייה להערכת מתחמי מיטוכונדריאלי ETC, מחשבי על ופרופילי פעילות מורכבים ETC. פרוטוקול זה מתאר את המדידה האופטימלית של קומפלקס חלבון ETC בחיסון מבוסס נוגדנים מרובי מולטיפלקסים והערכה סופר מורכבת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל כחול-ילידי.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה הייתה לספק צעדים מפורטים כדי להשיג הכנה מועשרת במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה בעבר עם טכנולוגיה חדשה של הפרעה מכנית באנרגיה נמוכה של רקמות המשפרת תמה רקמה ומיצוי של מיטוכונדריה. בשיטה זו, יעילות מיצוי משופרת מבלי ליצור מתח גיסת גבוה או טמפרטורה גבוהה וזמן הומוגניזציה קצר (10-12 s) הופכים בר ^השגה1.

כדי להשיג מיטוכונדריה מרקמה קפואה בארכיון הוא נכס בעל ערך לביצוע הן מחקרים ^{פונקציונליים2} והן ביוכימיים3 אחרת לא ניתן לחזור בקלות בתנאי הניסוי המדויקים. נעשה שימוש בהומוגניזר זכוכית קדר-אלווהג'ם טפלון קלאסי או הומוגניזר דונסה ועדיין נמצא בשימוש במעבדות מחקר להומוג....

Protocol

רקמות לב קפואות התקבלו מד"ר שון ניו-עולה יחד עם מכתב האישור המוסדי של IACUC. רקמות הלב התקבלו ממחקר אורך לטווח ארוך, פלאש קפוא בחנקן נוזלי, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי. כל הפרוטוקולים הנוגעים לעיבוד רקמת לב של צאצאים פעלו בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קנזס סיטי IBC וועדות IACUC.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים

הערה: הכן את כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן. השתמש במים מטוהרים במיוחד או שווה ערך בכל המתכונים ושלבי הפרוטוקול. ללבוש ציוד הגנה אישי (מעבדה לאיד, מסכת פנים, כפפות, ומשקפי מגן / מגן פנים) במהלך הליך זה. נפחי חוצץ מתאימים לעיבוד שש דגימות רקמה.

1. הכן חוצץ שטיפת רקמות ב-1.5 ליטר על-ידי שילוב של 154.0....

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, תשואה טובה של תערובת חלבון מועשר מיטוכונדריה מרקמת הלב הוכן. כ-15 מ"ג/מ"ל של תערובת חלבונים מועשרים במיטוכונדריה התקבלו מ-1.2 גרם רקמת לב קפואה בממוצע שנקצרה מצאצאי השזרה. תצפיות הצביעו על כך שפחות מ-0.5 גרם של רקמת לב קפואה לא הניבו כמות מספקת של תערובת חלבונים מועשרת במיטוכו?.......

Discussion

השלבים הקריטיים עבור פרוטוקול זה מצוינים כאן. ראשית, הומוגניזציה רקמות צריך להיות מטופל בקפידה, כך השפעות מוחלטות לא ייושמו במהלך תהליך הומוגניזציה רקמות. יש להשתמש במגרסת רקמות, המהווה חלק מטכנולוגיית רכיבה על אופניים בלחץ (PCT) להומוגניזציה ראשונית של ^רקמות9. צעד זה יפחית את ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino caproic acid	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit	Invitrogen	458199
anti-VDAC antibody	abcam	ab15895	use 1 µg/mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonin	Cabiochem	300410
Glass-Glass pestle homogenizer	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab	LICOR	LC0725
Multiwell plate reader	BioTek	Synergy HT
Native molecular weight marker	ThermoFisher	BN2001
Nylon mesh monofilament	Small Part Inc	CMN-74
Orbital shaker	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer	ThermoScienctific	37527
Shredder PULSE Tube	Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Table top centrifuge	Eppendorf	5418
Trypsin	Amresco	M150-1G
Trypsin inhibitor	Amresco	M191-1G	Requires fresh preparation