Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

Abstract

פרופיל קומפלקס העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלי (ETC) משתנה ברקמת הלב של הצאצא שנולד לזרועה מאומתנת. ההשערה שהוצעה ונבדקה הייתה שתרגיל אימהי קבוע של זריעה במהלך ההריון יגביר את היעילות המיטוכונדריאלית של ביו-אנרגטיקה של לב צאצאים. השערה זו נבדקה על ידי בידוד המיטוכונדריה באמצעות הליך בידוד מתון להערכת פרופילים מיטוכונדריאלי ETC וסופר-קומפלקס. ההליך המתואר כאן אפשר עיבוד של רקמות לב שהוקפאו בעבר בארכיון וביטל את הצורך בהכנת מיטוכונדריה טרייה להערכת מתחמי מיטוכונדריאלי ETC, מחשבי על ופרופילי פעילות מורכבים ETC. פרוטוקול זה מתאר את המדידה האופטימלית של קומפלקס חלבון ETC בחיסון מבוסס נוגדנים מרובי מולטיפלקסים והערכה סופר מורכבת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל כחול-ילידי.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה הייתה לספק צעדים מפורטים כדי להשיג הכנה מועשרת במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה בעבר עם טכנולוגיה חדשה של הפרעה מכנית באנרגיה נמוכה של רקמות המשפרת תמה רקמה ומיצוי של מיטוכונדריה. בשיטה זו, יעילות מיצוי משופרת מבלי ליצור מתח גיסת גבוה או טמפרטורה גבוהה וזמן הומוגניזציה קצר (10-12 s) הופכים בר השגה1.

כדי להשיג מיטוכונדריה מרקמה קפואה בארכיון הוא נכס בעל ערך לביצוע הן מחקרים פונקציונליים2 והן ביוכימיים3 אחרת לא ניתן לחזור בקלות בתנאי הניסוי המדויקים. נעשה שימוש בהומוגניזר זכוכית קדר-אלווהג'ם טפלון קלאסי או הומוגניזר דונסה ועדיין נמצא בשימוש במעבדות מחקר להומוג....

Protocol

רקמות לב קפואות התקבלו מד"ר שון ניו-עולה יחד עם מכתב האישור המוסדי של IACUC. רקמות הלב התקבלו ממחקר אורך לטווח ארוך, פלאש קפוא בחנקן נוזלי, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי. כל הפרוטוקולים הנוגעים לעיבוד רקמת לב של צאצאים פעלו בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קנזס סיטי IBC וועדות IACUC.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים

הערה: הכן את כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן. השתמש במים מטוהרים במיוחד או שווה ערך בכל המתכונים ושלבי הפרוטוקול. ללבוש ציוד הגנה אישי (מעבדה לאיד, מסכת פנים, כפפות, ומשקפי מגן / מגן פנים) במהלך הליך זה. נפחי חוצץ מתאימים לעיבוד שש דגימות רקמה.

  1. הכן חוצץ שטיפת רקמות ב-1.5 ליטר על-ידי שילוב של 154.0....

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול, תשואה טובה של תערובת חלבון מועשר מיטוכונדריה מרקמת הלב הוכן. כ-15 מ"ג/מ"ל של תערובת חלבונים מועשרים במיטוכונדריה התקבלו מ-1.2 גרם רקמת לב קפואה בממוצע שנקצרה מצאצאי השזרה. תצפיות הצביעו על כך שפחות מ-0.5 גרם של רקמת לב קפואה לא הניבו כמות מספקת של תערובת חלבונים מועשרת במיטוכו?.......

Discussion

השלבים הקריטיים עבור פרוטוקול זה מצוינים כאן. ראשית, הומוגניזציה רקמות צריך להיות מטופל בקפידה, כך השפעות מוחלטות לא ייושמו במהלך תהליך הומוגניזציה רקמות. יש להשתמש במגרסת רקמות, המהווה חלק מטכנולוגיית רכיבה על אופניים בלחץ (PCT) להומוגניזציה ראשונית של רקמות9. צעד זה יפחית את ?.......

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענק הפנים-ארצי של אוניברסיטת קנזס סיטי עבור עבדולבקי אגבאס ומלגת מחקר קיץ עבור דניאל בררה. המחברים אסירי תודה על עבודת העריכה של ד"ר יאן טאלי.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amino caproic acidSigma/AldrichA2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kitInvitrogen458199
anti-VDAC antibodyabcamab15895use 1 µg/mL
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninCabiochem300410
Glass-Glass pestle homogenizerVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit AbLICORLC0725
Multiwell plate readerBioTekSynergy HT
Native molecular weight markerThermoFisherBN2001
Nylon mesh monofilamentSmall Part IncCMN-74
Orbital shakerThermoScientfic
PCT ShredderPressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking bufferThermoScienctific37527
Shredder PULSE TubePressure Bioscience IncFT500-PS
Table top centrifugeEppendorf5418
TrypsinAmrescoM150-1G
Trypsin inhibitorAmrescoM191-1GRequires fresh preparation

References

  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved