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Ensaios automatizados usando microplatas multi-poços são abordagens vantajosas para identificar reguladores de vias, permitindo a avaliação de uma infinidade de condições em um único experimento. Aqui, adaptamos o bem estabelecido protocolo de imagem e quantificação de macropinoso para um formato de microplacão de 96 poços e fornecemos um contorno abrangente para automação usando um leitor de placas de vários modos.
Macropinocistose é uma via de absorção não específica da fase de fluidos que permite que as células internalizem grandes cargas extracelulares, como proteínas, patógenos e detritos celulares, através da endocitose a granel. Esse caminho desempenha um papel essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a regulação de respostas imunes e metabolismo de células cancerosas. Dada essa importância na função biológica, examinar as condições da cultura celular pode fornecer informações valiosas identificando reguladores dessa via e otimizando condições a serem empregadas na descoberta de novas abordagens terapêuticas. O estudo descreve uma técnica automatizada de imagem e análise utilizando equipamentos de laboratório padrão e um leitor de placas multimodestração de imagem celular para a rápida quantificação do índice macropinocítico em células aderentes. O método automatizado baseia-se na absorção de dextran fluorescente de alto peso molecular e pode ser aplicado a microplacões de 96 poços para facilitar avaliações de múltiplas condições em um experimento ou amostras fixas montadas em tampas de vidro. Esta abordagem visa maximizar a reprodutibilidade e reduzir a variação experimental, ao mesmo tempo em que economiza tempo e econômica.
A via endocítica não específica da macropinocistose permite que as células internalizem uma variedade de componentes extracelulares, incluindo nutrientes, proteínas, antígenos e patógenos, através da absorção em massa de fluido extracelular e seus constituintes1. Embora importante para a biologia de numerosos tipos celulares, cada vez mais, a via macropinotose é descrita como um papel essencial na biologia tumoral, onde, através da absorção macropinócítica, as células tumorais são capazes de sobreviver e proliferar na presença de um microambiente empobrecido de nutrientes2,3. A absorção....
1. Preparação de materiais
Quando as etapas e o ajuste do protocolo acima descrito são seguidos em conformidade, os resultados experimentais finais devem fornecer informações sobre se as condições de cultura celular estudadas ou inibidores induzem ou reduzem a macropinocistose na linha celular de interesse. Para fortalecer a validade desses achados, a inclusão das condições de controle permitirá a análise dos resultados para determinar se o experimento foi concluído com sucesso. Os controles de indução da macropinocitose fornecerão i.......
A qualidade dos experimentos e a aquisição de dados dependem muito da qualidade dos reagentes, da otimização das configurações e da limpeza das tampas e das microplacões. Os resultados finais devem dar uma variação mínima entre as réplicas; no entanto, as variações biológicas ocorrem naturalmente ou podem ser causadas por uma série de fatores. A densidade celular pode fazer com que as células respondam mais ou menos aos indutores ou inibidores da macropinocitose. É, portanto, crucial aderir à confluênc.......
C.C. é um inventor de uma patente emitida intitulada ''Diagnóstico de câncer, terapêutica e descoberta de medicamentos associados à macropinocistose'', Patente nº 9.983.194.
Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. é um beneficiário do TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). O BioTek Cytation 5 é uma parte do Núcleo de Imagens de Células Prebys de Sanford Burnham, que recebe apoio financeiro do NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). As figuras 1-3 foram criadas utilizando-se o BioRender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin | Corning | 25053CI | 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate |
1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
10-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | CELLSTAR |
15 mL Centrifuge tube | Fisherbrand | 07-200-886 | |
2 L Beaker | Fisherbrand | 02-591-33 | |
24-well Tissue culture plate | Greiner Bio-One | 662160 | CELLSTAR |
25 mL Reagent reservoir | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
500 mL Beaker | Fisherbrand | 02-591-30 | |
6-cm Tissue culture dish | Greiner Bio-One | 628160 | CELLSTAR |
8-Channel aspiration adapter | Integra Biosciences | 155503 | |
8-Channel aspiration adapter for standard tips | Integra Biosciences | 159024 | |
95% Ethanol | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
Ammonia-free glass cleaner | Sparkle | FUN20500CT | |
Black 96-well high-content screening microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
Cotton-tipped applicator | Fisherbrand | 23-400-101 | |
Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | 12 mm diameter |
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | Lysine-fixable |
Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
DPBS | Corning | 21031CV | Without Calcium and Magnesium |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Formaldehyde, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS Reagent Grade |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 | |
Hardening fluorescence mounting media | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | Certified ACS Plus, 36.5%–38.0% |
Lint-free wipes | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | Premium plain glass |
Multichannel pipette | Gilson | FA10013 | 8 channels, 0.5–10 µL |
Multichannel pipette | Gilson | FA10012 | 12 channels, 20–200 µL |
Multichannel pipette | Gilson | FA10011 | 8 channels, 20–200 µL |
Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
Plastic wrap | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
Silicone isolators | Grace Bio Labs Inc | 664107 | 13 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm |
Slide adapter | Biotek | 1220548 | |
Wash bottle | Fisherbrand | FB0340922C |
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