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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Ensaios automatizados usando microplatas multi-poços são abordagens vantajosas para identificar reguladores de vias, permitindo a avaliação de uma infinidade de condições em um único experimento. Aqui, adaptamos o bem estabelecido protocolo de imagem e quantificação de macropinoso para um formato de microplacão de 96 poços e fornecemos um contorno abrangente para automação usando um leitor de placas de vários modos.

Abstract

Macropinocistose é uma via de absorção não específica da fase de fluidos que permite que as células internalizem grandes cargas extracelulares, como proteínas, patógenos e detritos celulares, através da endocitose a granel. Esse caminho desempenha um papel essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a regulação de respostas imunes e metabolismo de células cancerosas. Dada essa importância na função biológica, examinar as condições da cultura celular pode fornecer informações valiosas identificando reguladores dessa via e otimizando condições a serem empregadas na descoberta de novas abordagens terapêuticas. O estudo descreve uma técnica automatizada de imagem e análise utilizando equipamentos de laboratório padrão e um leitor de placas multimodestração de imagem celular para a rápida quantificação do índice macropinocítico em células aderentes. O método automatizado baseia-se na absorção de dextran fluorescente de alto peso molecular e pode ser aplicado a microplacões de 96 poços para facilitar avaliações de múltiplas condições em um experimento ou amostras fixas montadas em tampas de vidro. Esta abordagem visa maximizar a reprodutibilidade e reduzir a variação experimental, ao mesmo tempo em que economiza tempo e econômica.

Introduction

A via endocítica não específica da macropinocistose permite que as células internalizem uma variedade de componentes extracelulares, incluindo nutrientes, proteínas, antígenos e patógenos, através da absorção em massa de fluido extracelular e seus constituintes1. Embora importante para a biologia de numerosos tipos celulares, cada vez mais, a via macropinotose é descrita como um papel essencial na biologia tumoral, onde, através da absorção macropinócítica, as células tumorais são capazes de sobreviver e proliferar na presença de um microambiente empobrecido de nutrientes2,3. A absorção....

Protocol

1. Preparação de materiais

  1. Dissolver 70 kDa dextran rotulado com FITC ou tetrametilrhodamina (TMR) em PBS para obter uma solução de 20 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C.
  2. Dissolver o DAPI no ddH2O para obter uma solução de 1 mg/mL. Armazene as alíquotas a -20 °C.
    ATENÇÃO: O DAPI é um potencial cancerígeno e deve ser tratado com cuidado.
  3. No dia da fixação, prepare formaldeído fresco de grau ACS de 3,7% na PBS.
    ATENÇÃO: O formaldeído é um carcinógeno f.......

Representative Results

Quando as etapas e o ajuste do protocolo acima descrito são seguidos em conformidade, os resultados experimentais finais devem fornecer informações sobre se as condições de cultura celular estudadas ou inibidores induzem ou reduzem a macropinocistose na linha celular de interesse. Para fortalecer a validade desses achados, a inclusão das condições de controle permitirá a análise dos resultados para determinar se o experimento foi concluído com sucesso. Os controles de indução da macropinocitose fornecerão i.......

Discussion

A qualidade dos experimentos e a aquisição de dados dependem muito da qualidade dos reagentes, da otimização das configurações e da limpeza das tampas e das microplacões. Os resultados finais devem dar uma variação mínima entre as réplicas; no entanto, as variações biológicas ocorrem naturalmente ou podem ser causadas por uma série de fatores. A densidade celular pode fazer com que as células respondam mais ou menos aos indutores ou inibidores da macropinocitose. É, portanto, crucial aderir à confluênc.......

Disclosures

C.C. é um inventor de uma patente emitida intitulada ''Diagnóstico de câncer, terapêutica e descoberta de medicamentos associados à macropinocistose'', Patente nº 9.983.194.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH/NCI (R01CA207189, R21CA243701) a C.C. KMO.G. é um beneficiário do TRDRP Postdoctoral Fellowship Award (T30FT0952). O BioTek Cytation 5 é uma parte do Núcleo de Imagens de Células Prebys de Sanford Burnham, que recebe apoio financeiro do NCI Cancer Center Support Grant (P30 CA030199). As figuras 1-3 foram criadas utilizando-se o BioRender.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinCorning25053CI0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate
1.5 mL Microcentrifuge tubeFisherbrand05-408-129
10-cm Tissue culture dishGreiner Bio-One664160CELLSTAR
15 mL Centrifuge tubeFisherbrand07-200-886
2 L BeakerFisherbrand02-591-33
24-well Tissue culture plateGreiner Bio-One662160CELLSTAR
25 mL Reagent reservoirGenesee Scientific Corporation28-121
500 mL BeakerFisherbrand02-591-30
6-cm Tissue culture dishGreiner Bio-One628160CELLSTAR
8-Channel aspiration adapterIntegra Biosciences155503
8-Channel aspiration adapter for standard tipsIntegra Biosciences159024
95% EthanolDecon Laboratories Inc4355226
Ammonia-free glass cleanerSparkleFUN20500CT
Black 96-well high-content screening microplatePerkinElmer6055300CellCarrier-96 Ultra
Cotton-tipped applicatorFisherbrand23-400-101
CoverslipsFisherbrand12-545-8012 mm diameter
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBiotekCYT5FW
DAPIMillipore Sigma5.08741
Dextran 70 kDa - FITCLife TechnologiesD1822Lysine-fixable
Dextran 70 kDa - TMRLife TechnologiesD1819
DMSOMillipore SigmaD1435
DPBSCorning21031CVWithout Calcium and Magnesium
ForcepsFine Science Tools11251-20Dumont #5
Formaldehyde, 37%Ricca ChemicalRSOF0010-250AACS Reagent Grade
GlycerolFisher BioReagentsBP229-1
Hardening fluorescence mounting mediaAgilent TechS302380-2DAKO
Hoechst 33342Millipore SigmaB2261
Hydrochloric acid (HCl)Fisher ChemicalA144-212Certified ACS Plus, 36.5%–38.0%
Lint-free wipesKimberly-Clark34155Kimwipes
Miscroscope slidesFisherbrand12-544-1Premium plain glass
Multichannel pipetteGilsonFA100138 channels, 0.5–10 µL
Multichannel pipetteGilsonFA10012 12 channels, 20–200 µL
Multichannel pipetteGilsonFA100118 channels, 20–200 µL
Parafilm MPechineyPM996
Plastic wrapKirkland Signature208733Stretch-Tite
Silicone isolatorsGrace Bio Labs Inc66410713 mm Diameter X 0.8 mm Depth ID, 25 mm X 25 mm
Slide adapterBiotek1220548
Wash bottleFisherbrandFB0340922C

References

  1. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21 (2020).
  2. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adapt....

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