Sequenziamento trasposone-inserzione come strumento per chiarire i fattori di colonizzazione batterica in un simbionte gladioli Burkholderia di Coleotteri Lagria villosa

Dedurre la funzione dei geni manipolando la loro attività è uno strumento essenziale per comprendere le basi genetiche della maggior parte dei processi biologici. I progressi della microbiologia molecolare hanno visto l'emergere di diverse tecniche di mutagenesi per la manipolazione dei geni. Tra questi, il sequenziamento trasposone-inserzione (Tn-seq) è uno strumento prezioso per valutare contemporaneamente la funzionalità di molti geni candidati in modo non target. La tecnica è stata fondamentale per identificare i meccanismi molecolari per la colonizzazione degli ospiti eucariotici in diversi microbi patogeni e alcuni simbionti benefici.

Qui, Tn-seq è stabilito come metodo per identificare i fattori di colonizzazione in un simbionte mutualistico Burkholderia gladioli del coleottero Lagria villosa. Per coniugazione, l'inserimento mediato da trasposoni Tn5 di una cassetta di resistenza agli antibiotici viene effettuato in posizioni genomiche casuali in B. gladioli. Per identificare l'effetto delle interruzioni geniche sulla capacità dei batteri di colonizzare l'ospite coleottero, la libreria di trasposoni-mutanti B. gladioli generata viene inoculata sulle uova del coleottero, mentre un controllo viene coltivato in vitro in un terreno di coltura liquido. Dopo aver concesso tempo sufficiente per la colonizzazione, il DNA viene estratto dalle biblioteche coltivate in vivo e in vitro. Seguendo un protocollo di preparazione della libreria del DNA, i campioni di DNA vengono preparati per il sequenziamento di trasposone-inserimento. Vengono selezionati frammenti di DNA che contengono il bordo dell'inserto del trasposone e il DNA batterico fiancheggiante e i siti di mutazione sono determinati sequenziando lontano dal bordo dell'inserto del trasposone. Infine, analizzando e confrontando le frequenze di ciascun mutante tra le librerie in vivo e in vitro, è possibile prevedere l'importanza di specifici geni simbionti durante la colonizzazione dei coleotteri.