Oxford Nanoimaging'e yapıcı geri bildirimleri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma 5UM1CA121947-10 tarafından R.P..M.'a ve 1R01DA040394'den D.P.D.'ye finanse edildi.

1 Hücre hatlarının yayılması ve bakımı
<ol><li>İnsan osteosarkom hücreleri (U2OS) alıp hücreleri %10 eksozom içermeyen Fetal Sığır Serumu ve 1x Penisilin/Streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş büyüme ortamına yerleştirin. NOT: McNamara et'te sunulan protokol sonrasında ekzozomsuz Fetal Sığır Serumu üretildi. al.26.</li>
	<li>U2OS hücrelerini % 5CO 2'de 37 °C'de bakır kaplı bir inkübatörde ve T175 şişelerinde geçiş hücrelerinde<sup class="xref"...

EV'ler, birçok hücre içi işlemdeki önemli rolleri ve hücreden hücreye sinyalizasyon1,30. Bununla birlikte, küçük boyutları ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altına düştüğü için görselleştirmelerinin zor olduğu kanıtlanır. Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), zaman içinde bireysel floroforların fotoğraf çekme olaylarını yakalayarak ve bu yanıp sönen olaylara dayanarak bir görüntüyü yeni...

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınan membran bağlı veziküllerdir. Lipitler, proteinler, metabolitler ve nükleik asitler içerirler ve bu malzemeleri hücreler arasında lokal olarak ve dokular ve organlar arasında distal olarak aktarırlar. EV'lerin üç ana alt tipi vardır: apoptotik cisimler, mikrovesiküller ve ekzozomlar1,2. Burada, tartışmamızı eksozomlara ve ilişkili proteinlerine odaklıyoruz.
Ekzozomlar, erken endozomların çokvesiküler vücuda (MVB) içe doğru tomurcuklanmasından kaynaklanan veziküller salgılanır. MVB daha sonra plazma zarı ile kaynaşır ve eksozomları hücre dışı alana serbest bırakarak diğer hücrelere3,4. Ekzozomlar 40 ila 150 nm arasında değişen boyutlarda bulunur ve tetraspaninler (CD9, CD63, CD81), taşıma için gerekli olan membran bağlı endosomal sıralama kompleksi (ESCRT) ve lipid sal ile ilişkili proteinler 1,2 ,5,6,7olarak bilinen endosomal transmembran proteinleri ile zenginleştirilir.
Eksozomların biyokimyasal makyajını karakterize etmek, araştırmacıların işlevsel doğalarını daha iyi anlamaları için popüler bir alan haline gelmiştir. Nano ölçekli akış sitometrisi, nanopartikül izleme analizi (NTA), tarama ve iletim elektron mikroskopisi (TEM), yüzey plazmon rezonansı, dirençli darbe algılama ve her biri8,9eksileri içeren geleneksel ışık mikroskopisi dahil olmak üzere eksozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için birçok yöntem mevcuttur. TEM ve kriyo-EM nanometre tabanlı çözünürlük elde edebilir, ancak genellikle susuz bırakma ve donma-kırılma adımları gerektirir, böylece 10,11 EV'leriküçültür veya yutabilir. NTA, aynı anda yüzlerce EV'nin karakterizasyonuna izin vererek ışık saçılımlarına dayanır, ancak parçacık boyutunun dolaylı bir ölçümüdür ve EV'ler, virüsler ve protein agregaları arasında kolayca ayırt edemez12 , 13,14,15,16. Nano ölçekli akış sitometrisi, daha sonra boyut ölçümlerine çevrilebilen bir heyecan yolundan ışık saçılımını istihdam eder, ancak gelişmekte olan bir teknolojidir ve çeşitli aletler için doğrusal algılama aralığında parçacıkların boyutu hakkında çok az fikir birliği vardır12,17,18.
Floresan proteinler veya boyalar kullanılarak geleneksel ışık mikroskopisi, hücre altı bölmeleri, protein komplekslerini ve bir hücre içindeki sinyal makinelerini görselleştirmek için en yoğun kullanılan tekniklerden biri olmuştur. Bu teknik komplekslerin lokalizasyonunu görselleştirmede yararlı olsa da, geleneksel ışık mikroskopisinin kırınım sınırı (yaklaşık 250-400 nm), bir ekzozom (40-150 nm) 12,19,20'nin tipik boyut aralığındaki proteinlerin veya yapıların net çözünürlüğünü önler.
Süper çözünürlüklü mikroskopi, yani doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), belirli floroforların fotowitchable özelliklerini kullanarak ve görüntüleri nanometre hassasiyeti21'ekadar yeniden oluşturmak için bu yanıp sönen olayları algılayarak geleneksel ışık mikroskopisinden kendini ayırır. Photoswitching olayları, on binlerce bireysel pozlama boyunca yüksek kare hızında algılama kamerası kullanılarak toplanır ve fotoğraf çekme floroforunun tam konumunu yüksek güvenle haritalamak için bir nokta yayma işlevi kullanılır19,20,22. Bu, dSTORM'un ışık mikroskopisinin kırınım sınırını atlamasına izin verir. Çeşitli gruplar, eksozomları ve ilişkili proteinleri22 , 23 , 24,25'igörselleştirmek ve izlemek için süper çözünürlüklü tekniklerin kullanıldığını bildirmektedir. Son çözünürlük floroforun biyofiziksel özelliklerine bağlıdır, ancak genellikle XY ekseni boyunca +/-10-100 nm arasında değişerek tek moleküllü çözünürlüğe izin verir.
XY ekseninde bu ölçekte bireysel floroforları çözme yeteneği mikroskopide devrim yaratmamıştır. Ancak, bir eksozom üç boyutlu (3-B) dSTORM hakkında çok az veri vardır. Bu nedenle, 3 boyutlu nanometre hassasiyetine ekozomlar da dahil olmak üzere saflaştırılmış EV'lerin dSTORM tabanlı görselleştirilmesi ve karakterizasyonu için standart bir işletim prosedürü (SÇP) oluşturmaya çalıştık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Hücre dışı veziküller (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınır ve hücre sinyalizasyonu ve homeostazda önemli bir rol oynar. EV'lerin görselleştirilmesi genellikle tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altında olan küçük çapları (40-250 nm) nedeniyle dolaylı yöntemler gerektirir. Kırınım sınırını hem iki hem de üç boyutta atlamak için EV'lerin süper çözünürlüklü mikroskopi tabanlı bir görselleştirmesini geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, EV'lerin üç boyutlu şeklini XY ekseninde +/- 20 nm çözünürlüğe ve Z ekseni boyunca +/- 50 nm çözünürlüğe çözebiliriz. Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopinin, ekzozomlar ve zarflı virüsler de dahil olmak üzere EV'lerin bir karakterizasyon yöntemi olarak kabul edilmesini öneriyoruz.

Bu çalışmanın amacı, nanometre çözünürlüğü olan bireysel EV'lerin üç boyutlu olarak (3-D) görselleştirilmesinde süper çözünürlüklü mikroskopinin etkinliğini değerlendirmektir. Bireysel EV'lerin şeklini ve boyutunu analiz etmek için, fotoğraflanabilir boya kullandık ve EV'leri uzak kırmızı, membran aralayıcı bir boya ile kuluçkaya yatırdık ve kromatografi29aracılığıyla fazla boyayı çıkardık. Benzeşim yakalanan anti-CD81 ve kırmızı lekeli EV'ler daha ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Bu protokol, kırınım sınırını atlamak ve EV'leri üç boyutta nanometre hassasiyetiyle görselleştirmek için dSTORM olarak da bilinen stochastic optik rekonstrüksiyon mikroskopisini özellikle doğrudan doğrudan kullanır. dSTORM'un önemli bir avantajı, EV'nin biyokimyasal doğasını değiştiren adımlara zarar vermeden ışığın kırınım seviyesinin altındaki parçacıkları doğrudan görselleştirme yeteneğidir. Evrimsel olarak farklı birçok virüs EV sinyali verir, bu nedenle dSTORM, hastalık biyobelirteçleri ve ilerlemesi için EV'leri karakterize etmek ve SARS-CoV2 gibi bireysel virüs parçacıklarını görselleştirmek için kullanılabilir. Benzeşimli, hücre dışı veziküller veya EV'leri cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu plakalara toplam 200 mikrolitre hacimde yerleştirerek başlayın ve dört santigrat derecede bir gecede yüzeye yapışmalarını sağlar.Mevcut çözeltiyi sekiz kuyulu plakadan çıkarmadan, her kuyudaki EV içeren çözeltiye 1X PBS'de %4 paraformaldehitten oluşan 200 mikrolitre ekleyerek EV'leri plakalara sabitleyin ve plakaların oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. EV'leri rahatsız etmemek için paraformaldehit ve fazla çözeltiyi bir mikropipette dikkatlice çıkarın. Fazla paraformaldehit gidermek için EV'yi 1X PBS ile yıkayın.Yıkama prosedürünü üç kez gerçekleştirin. Fazla 1X PBS'yi çıkarın. Üreticinin protokolüne göre görüntüleme tamponunda seyreltilmiş beş milimolar protocatechuic dioksijenaz çözeltisi oluşturarak numune başına 250 mikrolitre dSTORM Bcubed tampon çözeltisi hazırlayın.Üretici protokolüne göre her birine 250 mikrolitre hazırlanan tamponu ekleyin ve oksitleyici molekülleri çöpe atmadan önce plakaları oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya bırakın. EV'ler hemen görselleştirilebilir veya bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Süper çözünürlüklü mikroskobun kalibrasyonu için gerekli boncukları hazırlamak için, 100 nanometre mikrokürecikleri moleküler biyoloji sınıfı suda% 0,5 konsantrasyonda seyreltin ve pipet 200 mikrolitreyi cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu bir plakanın her kuyusuna seyreltin.Boncukların oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyulara yerleşmesine izin verin. Mevcut çözeltiyi çıkarmadan, kalibrasyon boncuk çözeltisine her kuyuya PBS'de% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin. Boncukları rahatsız etmemek için paraformaldehiti bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve boncukları 1X PBS ile üç kez yıkayın.Arabelleği yazıda açıklandığı gibi hazırlayın. 1X PBS'yi çıkarın ve hazırlanan tamponun her kuyuya 250 mikrolitresini ekleyin. Arabelleğin görselleştirmeden önce 20 dakika oturmasına izin verin.Sahne alanına herhangi bir şey yerleştirmeden önce 3B mikroskoplara bağlanmak için Mikroskobu Bağla düğmesini kullanın. Hedefe 100X yağ ekleyin ve kuyunun merkezini hedefin üzerine yerleştirin. Edin ayarında, 473 ve 640 nanometrelik heyecan lazerlerini açın ve Görüntüle'ye tıklayın.3D lensi etkinleştirmeden, Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'ndeki Foton sayılarına tıklayarak foton doygunluğu ayarının altındaki boncukları görüntüleyin. İlk lazer güçlerini 473 nanometre lazer için 8,4 miliwatt ve 640 nanometre lazer için 11,6 miliwatt olarak ayarlayın. Lazerin odağını eksi 300 nanometreye veya kalibrasyon boncuklarının odak düzlemine düşürerek tek tek boncukların net bir çözünürlüğünü üretin.Z düzlemi odaklandıktan sonra, lazer güç seviyelerini her görüş alanındaki varyasyonu hesaba katacak şekilde daha fazla ayarlayın. Cihaz işlevleri altında, X, Y ve Z eksenindeki hataları elde etmek için 3B haritalama kalibrasyonunu ve kanal eşleme kalibrasyonunu tamamlayın. kanal eşleme kalibrasyonu sırasında en fazla görüş alanı sayısını 20'ye, hedef nokta sayısını 4.000'e, kanallar arasındaki maksimum mesafeyi 5,0 piksele ve kanallar arasındaki dışlama yarıçapını 10,0 piksel olarak ayarlayın.Kalibrasyonun %90'dan daha yüksek bir nokta kapsama alanı ve iyi bir haritalama kalitesi ürettiğinden emin olun. Verilen kalibrasyon verilerini gelecekteki görüntü alımları için kaydedin. Hedefe 100X yağ ekleyin ve hazırlanan EV'leri mikroskopa yerleştirin.3D lensi etkinleştirmeden, 640 nanometrelik ekscitasyon lazerini açın ve kırmızı membran, interkalasyon, boya lekeli EV'leri heyecanlandırmak için görüş alanındaki sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak başlangıçta 1,2 ila 12,5 miliwatt'a yükseltin. Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'nin altında, EV'leri daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yöntemini foton doygunluğundan yüzdelik dilimlere geçirin. Sinyali en üst düzeye çıkarırken gürültüyü en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın ve diğer tüm parametreleri koruyun.Z eksenindeki yukarı veya aşağı simgesini tıklatarak Z düzleminin odağını ayarlayın. Pozlama süresini 20 milisaniye, kare yakalamayı 10.000 kareye ve ilk lazer gücünü sinyalin yoğunluğuna ve görüş alanına bağlı olarak 1,2 ila 12,5 miliwatt arasında ayarlayın. Simgeyi kullanarak 3D lensi etkinleştirin ve Edin düğmesine tıklayarak satın almayı başlatın.Görüntü alma işlemi boyunca lazer gücünü her 1000 karede üç artışla veya yüksek sinyal-gürültü oranını korumak için yeterli artırarak artırın. Satın alma sırasında Z düzlemini ayarlamayın. Görüntü alımından sonra, Görüntülemeyi çözümle penceresine geçiş yapma.Filtrelenmemiş görüntüde sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin ve filtreleri etkinleştirin. Yazıda belirtildiği gibi foton sayısını, yerelleştirme hassasiyetini, sigmaları ve çerçeve dizinini ayarlayın. Tek tek EV'lerin X ekseni boyunca bir X, Y, Z düzlemi görüntüleme aracını görüntüleme alanından kaplayın ve fotoğraf çekme olaylarının tek tek csv dosyalarını dışa aktarın.Fotoğraf çekme olaylarını ayarlanan mesafe gruplarına sabitleyen bir Çizgi Histogram aracı kullanarak X üzerindeki tek tek EV'leri, X x Y görüş alanındaki Y eksenini ikiye ayırın. Tek EV'lerin görüntülerini alın ve bunları tif dosyaları olarak kaydedin. Z ekseni boyunca yerleşime göre bir 3B görselleştirme aracı ve rengi kullanarak tek tek EV'lerin 3B videolarını oluşturun.X, Y ekseninde ortalama 16 nanometre ve Z ekseninde 38 nanometre hata üreten mikroskobun kalibrasyonunun ardından, saflaştırılmış u20'ler EV'ler X, Y ekseninde 20 nanometreye kadar çözünürlük ve Z ekseni boyunca 50 nanometre ile başarıyla görselleştirildi. Lazer gücü arttıkça 10.000 kare pozlama boyunca 3D fotoğraflarda dSTORM aracılığıyla görselleştirilen bireysel EV'ler, elde edilen görüntüde kolayca belirgindi. Z düzleminde alım sonrası görüntü düzeltmesi, foton sayıları, sigmalar ve yeniden yapılanan görüntünün yerelleştirme hassasiyeti, EV'nin 3D olarak net bir şekilde çözülmesine neden oldu.EV fotoğrafları, sağ üst köşedeki gösterge tarafından görüldüğü gibi, yalnızca ilk 7.000 kare sırasında yeniden görüntülendi. Histogram, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğrular, görselleştirilmiş EV'nin bir ekzozom olduğunu ve küçük çaplı EV'lerin izolasyonunun başarılı olduğunu doğrular. Hat Histogram aracı ve X, Y, Z-plane View aracı kullanılarak ayrı ayrı izlenen diğer EV'lerde gerçekleştirilen boyut dağılımı analizi, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun merkezin 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğruladı.Z ekseni boyunca hata artırıldı ve eksenel eksen boyunca EV'nin uzun bir son görüntüsü üretildi. Fotoğraf çekme olayları EV boyutuyla ilişkili değildi, bu da dSTORM tabanlı karakterizasyonun ekzozomlar gibi küçük EV'ler ve çapı 100 nanometreden küçük, zarflı virüsler için kullanılabileceğini gösterdi. dSTORM gerçekleştirirken, ilk lazer gücünü çok düşük ayarlamayı ve fotobleaching'i önlemek için görüntü alımı boyunca yavaşça yükseltmeyi hatırlamak önemlidir.Gelişiminden bu yana, dSTORM araştırmacıların tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırı nedeniyle daha önce görselleştirilmesi imkansız olan hücre altı yapıların morfolojisini daha iyi anlamalarını sağladı.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Abstract