Bedömning av inochondriell proteinlokalisering i spirande jäst sackaromyces cerevisiae

Trots de senaste framstegen i karakteriseringen av jäst mitokondriellt proteom, är den inochondriella lokaliseringen av ett betydande antal proteiner fortfarande svårfångad. Här beskriver vi en robust och effektiv metod för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner, som anses vara ett grundläggande steg under mitokondriell protein funktion klarering. Denna metod innebär ett första steg som består av att erhålla mycket ren intakt mitokondrier. Dessa mitokondriella preparat utsätts sedan för ett subfractionationsprotokoll bestående av hypoton chock (svullnad) och inkubation med proteinas K (proteas). Under svullnad störs det yttre mitokondriella membranet selektivt, vilket gör det möjligt för proteinaset K att smälta proteiner i det intermembrana rymdutrymmet. Parallellt, för att få information om topologin av membranproteiner, soniskas först mitokondriella preparat och utsätts sedan för alkalisk extraktion med natriumkarbonat. Slutligen, efter centrifugering, analyseras pellet- och supernatantfraktionerna från dessa olika behandlingar av SDS-PAGE och western blot. Den submitochondriella lokaliseringen samt membrantopologin hos proteinet av intresse erhålls genom att jämföra dess västra fläckprofil med kända standarder.