Vi takker Dr. Moutusee Jubaida Islam og Dr. Luke Joyce for deres bidrag til denne protokol. Vi vil også gerne anerkende University of Texas i Dallas Genome Center for deres feedback og støtte. Dette arbejde blev finansieret af Welch Foundation, tildelingsnummer AT-2030-20200401 til NJD, af National Institutes of Health, tildelingsnummer R01AI116610 til K.P., og af Felecia og John Cain Chair in Women's Health, der ejes af P.E.Z.

Forfatterne har intet at afsløre.

Den omfattende hybrid genom samling protokol beskrevet her tilbyder en strømlinet tilgang til en vellykket dyrkning af forskellige urinmikrobiota og uropathogener, og den komplette samling af deres genomer. Vellykket WGS af bakterielle genomer begynder med isolering af forskellige og til tider kræsne mikrober for at udtrække deres genomiske DNA. Til dato mangler eksisterende urinkulturprotokoller enten den nødvendige følsomhed til at opdage mange urinarter eller involverer langvarige og omfattende tilgange, der kræver forlænget tid og ressourcer11. Den beskrevne metode for modificeret forbedret urinkultur tilbyder en forenklet, men omfattende protokol for vellykket isolering af bakterier, der tilhører 17 almindelige uringener, herunder potentielt patogene eller gavnlige commensale arter og både fakultetsmæssige og obligatoriske aerobe eller anaerobe bakterier. Dette giver igen det nødvendige udgangsmateriale til nøjagtig sekventering og samling af bakterielle genomer og til kritiske fænotypiske eksperimenter, som bidrager til forståelsen af urin sundhed og sygdom. Desuden giver denne ændrede kulturtilgang mulighed for en mere defineret klinisk diagnose af levedygtige mikroorganismer, der findes i urinprøver, og giver mulighed for deres biobanking til fremtidige genomiske undersøgelser. Denne protokol er dog ikke uden begrænsninger. Det kan kræve lange inkubationstider afhængigt af organismen samt brug af ressourcer såsom et hypoxikammer eller kontrollerede inkubatorer, der måske ikke er let tilgængelige. Brugen af anaerobe GasPaks tilbyder en alternativ løsning, men disse er dyre og giver ikke altid et vedvarende og kontrolleret miljø. Endelig kan kultur bias samt prøve mangfoldighed give mulighed for særlige organismer og uropathogener at udkonkurrere kræsne bakterier. På trods af disse begrænsninger, en kultur af forskellige urinbakterier er muliggjort af denne tilgang.
Genomisk sekventering har vundet popularitet med udviklingen af Next Generation Sekventering teknologier, som enormt øget både udbytte og nøjagtigheden af sekventering data14,15. Kombineret med udviklingen af algoritmer til databehandling og de novo-samling er komplette genomsekvenser lige ved hånden på både nybegyndere og ekspertforskere15,45. Kendskab til den samlede genomorganisation, der leveres af komplette genomer, giver vigtig evolutionær og biologisk indsigt, herunder genduplikation, gentab og horisontal genoverførsel14. Derudover er gener, der er vigtige for antimikrobiel resistens og virulens, ofte lokaliseret på mobile elementer, som typisk ikke løses i udkast til genomsamlinger15,16.
Protokollen heri følger en hybrid tilgang til kombinationen af sekventering af data fra kortlæste og langlæste platforme til at generere komplette genomsamlinger. Mens fokuseret på urinbakterielle genomer, denne procedure kan tilpasses forskellige bakterier fra forskellige isolationskilder. Kritiske skridt i denne tilgang omfatter følgende passende steril teknik og udnytte passende medier og kultur betingelser for isolering af rene urinbakterier. Desuden er ekstraktion af intakt, højtydende gDNA afgørende for at generere sekventeringsdata uden forurenende aflæsninger, der kan hæmme montagesuccesen. Efterfølgende bibliotek forberedelse protokoller er afgørende for generering af kvalitet læser af tilstrækkelig længde og dybde. Derfor er det af total betydning at håndtere gDNA med omhu under biblioteksforberedelse til langlæst sekventering i særdeleshed, da denne teknologis største fordel er den generation af lange læser uden teoretisk øvre længdegrænse. Også skitseret er sektioner for passende kvalitetskontrol (QC) af sekventering læser, der eliminerer støjende data og forbedrer montageresultatet.
På trods af vellykket DNA-isolation, biblioteksforberedelse og sekventering kan arten af genomisk arkitektur af nogle arter stadig udgøre en hindring for dannelsen af en lukket genomsamling45,46. Gentagne sekvenser komplicerer ofte montageberegningen, og på trods af lange læsedata kan disse områder løses med lav tillid eller slet ikke. Lange aflæsninger skal således i gennemsnit være længere end den største gentagne region i genomet, eller dækningen skal være høj (>100x)19. Nogle genomer kan forblive ufuldstændige og kræver manuelle tilgange til færdiggørelse. Ikke desto mindre består hybridsamlede ufuldstændige genomer typisk af færre kontiger end kortlæste udkast til genomer. Det kan hjælpe at justere standardparametrene for assemblyalgoritmen eller følge strengere skæringer for læsning af QC. Alternativt er en foreslået tilgang at kortlægge lange læser til de ufuldstændige regioner på jagt efter beviser for den mest sandsynlige samling sti, og derefter bekræfte stien udnytte PCR og Sanger sekventering af den forstærkede region. Kortlægning læser ved hjælp af Minimap2 foreslås, og Bandage tilbyder et nyttigt værktøj til visualisering af kortlagte læser langs samlede contigs giver bevis for contig linkage47.
En yderligere udfordring med at generere komplette genomer ligger i fortrolighed og komfort med kommandolinjeværktøjer. Mange bioinformatiske værktøjer er udviklet til at tilbyde beregningsmæssige muligheder for enhver bruger; Deres udnyttelse afhænger dog af en forståelse med det grundlæggende i UNIX og programmering. Denne protokol har til formål at give tilstrækkeligt detaljerede instruktioner til at gøre det muligt for personer uden forudgående kommandolinjeerfaring at generere lukkede genomsamlinger og anmærke dem.

Urinmikrobiomet er et nyt forskningsområde, der har knust en årtier lang misforståelse om, at urinvejene er sterile hos raske individer. Medlemmer af urinmikrobiota kan tjene til at afbalancere urinmiljøet og forhindre urinvejsinfektion (UTI)1,2. Uropatogene bakterier invaderer urinvejene og anvender forskellige virulensmekanismer til at fortrænge det residente mikrobiota, kolonisere urotelet, undgå immunrespons og modvirkemiljøbelastninger 3,4. Urin er et relativt næringsrigt medium karakteriseret ved høj osmolaritet, begrænset kvælstof- og kulhydrattilgængelighed, lav iltning og lav pH5,6,7. Urin anses også for at være antimikrobiel, der består af høje koncentrationer af hæmmende urinstof og antimikrobielle peptider som den menneskelige cathelicidin LL-378. Undersøgelsesmekanismer, der anvendes af både hjemmehørende bakterier og uropathogener til at kolonisere urinvejene er afgørende for yderligere at forstå urinvejs sundhed og udvikle nye strategier for UTI behandling. Desuden, som svigt af front-line antimikrobielle behandlinger bliver mere almindelige, er det stadig vigtigere at overvåge udbredelsen af mobile genetiske elementer, der bærer antimikrobiel resistens determinanter i populationer af urinbakterier9,10.
At undersøge genotyper og fænotyper af urinbakterier, deres succesfulde kultur og efterfølgende hele genom sekventering (WGS) er bydende nødvendigt. Kulturafhængige metoder er nødvendige for at opdage og identificere levedygtige mikrober i urinprøver11. Standard klinisk urin kultur indebærer plating urin på 5% får blod agar (BAP) og MacConkey agar og inkubation aerobt ved 35 °C for 24 timer12. Men med en detektionstærskel på ≥10 5 CFU/mL13, mange medlemmer af urinmikrobiota er ikke rapporteret af denne metode. Forbedrede dyrkningsteknikker som forbedret kvantitativ urinkultur (EQUC)11 anvender forskellige kombinationer af forskellige urinmængder, inkubationstider, kulturmedier og atmosfæriske forhold for at identificere mikrober, der almindeligvis savnes af standard urinkultur. Beskrevet i denne protokol er en modificeret version af EQUC, der her kaldes Modified Enhanced Urine Culture protocol, der muliggør dyrkning af forskellige urinbakterier og uropatogener ved hjælp af selektive medier og optimale atmosfæriske forhold, men er ikke i sagens natur kvantitativ. Den vellykkede isolering af urinbakterier muliggør udvinding af genomisk DNA (gDNA) til downstream WGS og genomsamling.
Genom forsamlinger, komplette samlinger i særdeleshed, muliggøre opdagelsen af genetiske faktorer, der kan bidrage til kolonisering, niche vedligeholdelse, og virulens blandt både hjemmehørende mikrobiota og uropatogene bakterier. Udkast til genomsamlinger indeholder et varieret antal sammenhængende sekvenser (kontiger), der kan indeholde sekventeringsfejl og manglende orienteringsoplysninger. I en komplet genomsamling er både retningen og nøjagtigheden af hvert basispar blevet verificeret14. Desuden giver opnåelse af komplette genomsekvenser indsigt i genomstruktur, genetisk mangfoldighed og mobile genetiske elementer15. Korte læser alene kan identificere tilstedeværelsen eller fraværet af vigtige gener, men kan ikke lokalisere deres genomiske sammenhæng16. Med muliggør langaflæste sekventering teknologier såsom Oxford Nanopore og PacBio, generere lukkede de novo samlinger af bakterielle genomer ikke længere kræver anstrengende metoder såsom manuel lukning af de novo samlinger af multiplex PCR17,18. Kombinationen af Next Generation kortlæst sekventering og Nanopore langaflæste sekventering teknologier giver mulighed for letkøbt generation af nøjagtige, komplette og lukkede bakterielle genom samlinger med relativt lave omkostninger19. Kortlæst sekventering producerer nøjagtige, men fragmenterede genomsamlinger, der generelt består af et gennemsnit på 40-100 kontiger, mens Nanopore sekventering genererer lange aflæsninger på ca. 5-100 kb i længden, der er mindre nøjagtige, men kan tjene som stilladser til at slutte sig til kontigs og løse genomisk synteny. Hybride tilgange, der anvender både kortlæste og langlæste teknologier, kan producere nøjagtige og komplette bakterielle genomer19.
Beskrevet her er en omfattende protokol for isolering og identifikation af bakterier fra human urin, genomisk DNA-ekstraktion, sekventering, og komplet genom samling ved hjælp af en hybrid samling tilgang. Denne protokol lægger særlig vægt på de nødvendige skridt til korrekt at ændre aflæsninger genereret af kortlæst og langlæst sekventering for nøjagtig samling af et lukket bakteriekromosom og ekstrakromosomelementer som plasmid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29398A</td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>--</td>
			<td>Any centrifuge for spinning conicals and microcentrifuge tubes (e.g. Models 5810R/5424R)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis</td>
			<td>BioRad Laboratories</td>
			<td>1645070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>BioRad Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>ChemiDoc models</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Any CO2 Incubator (e.g. Thermo Forma model 3110)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Rack</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S15095</td>
			<td>12-tube rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinION</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>Other Illumina models are acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>--</td>
			<td>Synergy H1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>H2024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>--</td>
			<td>Any thermocycler for PCR reactions (e.g. ProFlex PCR system)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP3991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X TBE buffer</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>1M Tris,1M Boric Acid,0.2M EDTA (pH 8.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1429R primer</td>
			<td>Sigma Aldrich (Custom oligos)</td>
			<td>--</td>
			<td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1kb Ladder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101228-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-Cl (pH 7.5)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x Loading dye</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0783588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8F primer</td>
			<td>Sigma Aldrich (Custom oligos)</td>
			<td>--</td>
			<td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad Laboratories</td>
			<td>63001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobe Pouch System - GasPak EZ</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>B260683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A73-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>212304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDC Anaerobe 5% Sheep Blood Agar</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>L007357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Orientation</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>PA-257481.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Anaerobic Indicator Strips</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>271051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>For molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP130210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell priming kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-FLP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell wash kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-WSH003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Miniprep Kit</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>BS654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation sequencing kit</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>SQK-LSK109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>L381005.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mutanolysin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9901-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native barcoding expansion 1-12</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>EXP-NBD104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0367L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext FFPE DNA Repair Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M6630L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext quick ligation buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B6058S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing module</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7546L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA CD Indexes</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20018708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20018705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6056L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R9 Flow cell</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>FLO-MIN106D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep Blood</td>
			<td>Hemostat Laboratories</td>
			<td>DS13250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE buffer</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>BD Diagnostic Systems</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software &#38; Bioinformatic Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandage</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://rrwick.github.io/Bandage/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center for Genomic Epidemiology</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>http://www.genomicepidemiology.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLC Genomics Workbench 12</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPRcasFinder</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious Prime</td>
			<td>Geneious</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gVolante (BUSCO)</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://gvolante.riken.jp/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kbase Prokka Wrapper</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimap2</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://github.com/lh3/minimap2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinKNOW</td>
			<td>Oxford Nanopore Technologies</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFilt</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://github.com/wdecoster/nanofilt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoStat</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://github.com/wdecoster/nanostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHASTER</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://phaster.ca/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prokka</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://github.com/tseemann/prokka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUAST</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>http://quast.sourceforge.net/quast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trim Galore</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicycler</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid de novo genome assembly for the generation of complete genomes of urinary bacteria using short- and long-read sequencing technologies

Komplette genomsekvenser giver værdifulde data til forståelse af genetisk mangfoldighed og unikke koloniseringsfaktorer af urinmikrober. Disse data kan omfatte mobile genetiske elementer, såsom plasmider og ekstrakromosom phage, der bidrager til udbredelsen af antimikrobiel resistens og yderligere komplicere behandling af urinvejsinfektion (UTI). Ud over at give fin opløsning af genomstrukturen giver komplette, lukkede genomer mulighed for detaljerede komparative genomforskninger og evolutionære analyser. Generering af komplette genomer de novo har længe været en udfordrende opgave på grund af begrænsninger af tilgængelig sekventeringsteknologi. Paired-end Next Generation Sekventering (NGS) producerer korte aflæsninger af høj kvalitet, hvilket ofte resulterer i nøjagtige, men fragmenterede genomsamlinger. Tværtimod giver Nanopore sekventering lange aflæsninger af lavere kvalitet, der normalt fører til fejlbehæftede komplette samlinger. Sådanne fejl kan hæmme foreningsundersøgelser for hele genomet eller give vildledende analyseresultater for varianter. Derfor hybrid tilgange kombinerer både korte og lange læser har vist sig som pålidelige metoder til at opnå meget præcise lukkede bakterielle genomer. Rapporteret heri er en omfattende metode til kultur af forskellige urinbakterier, artsidentifikation af 16S rRNA-gensekvensering, ekstraktion af genomisk DNA (gDNA) og generering af henholdsvis korte og lange læsninger af henholdsvis NGS- og Nanopore-platforme. Derudover beskriver denne metode en bioinformatisk pipeline af kvalitetskontrol, samling og genforudsigelsesalgoritmer til generering af kommenterede komplette genomsekvenser. Kombination af bioinformatiske værktøjer gør det muligt at vælge læsedata af høj kvalitet til hybridgenommontering og downstream-analyse. Den strømlinede tilgang til hybrid de novo genomsamlingen, der er beskrevet i denne protokol, kan tilpasses til brug i eventuelle kultter.

Denne protokol er optimeret til kultur og sekventering af urinbakterier, der tilhører de slægter, der er anført i figur 1. Ikke alle urinbakterier kan kult med denne metode. Kulturmedier og -betingelser er specificeret af slægten i figur 1. Eksemplariske gelelektroforesevurderinger af gDNA-integritet er afbildet i figur 2. En oversigt over bioinformatikrørledningen til sekventering af læsebehandling, genomassembly og anmærkning er beskrevet i figur 3. Der findes en vejledning i beregningsmappestruktur i figur 4 for både at forenkle protokolforståelsen og skabe rammer for en vellykket organisation. Desuden indgår er repræsentative komplette genomer af to Klebsiella spp., K. pneumoniae og K. oxytoca, der blev genereret af denne protokol. En repræsentation af disse forsamlinger findes i figur 5 og indeholder også et yderligere ufuldstændigt eksempel K. pneumoniae genom. En detaljeret oversigt over hvert fuldt kommenteret komplet genom er vist i figur 6. Endelig findes der et resumé af sekventeringslæsningsstatistikkerne i tabel 1 for at give en bred forståelse af rådata og trimmede data, der er tilstrækkelige til generering af lukkede genomsamlinger af høj kvalitet. Derudover udfylder nøgleparametrene for de to repræsentative Klebsiella spp. genomer er angivet. Genomer og rådata blev deponeret i Genbank under BioProject PRJNA683049.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> Figur 1: Modificeret forbedret urinkultur af forskellige uringener. Diagram for agar og flydende bouillon, der kan bruges til at dyrke forskellige urin slægter. Alle dyrkninger foreslås udført ved 35 °C som beskrevet i underafsnit 1.1. Cirkler repræsenterer medier, der er egnede til dyrkning af en bestemt slægt, farver blev vilkårligt valgt for at skelne en medietype fra en anden. CDC-AN BAP (rød), CDC Anaerobe Får Blood Agar; 5% Får-BAP (orange), Får Blood Agar; BHI (grøn), Hjernehjerte infusion; TSB (gul), Tryptic Soja Bouillon; ChroMagar Orientering (blå). enGardnerella vaginalis bør dyrkes på HBT Bilayer G. vaginalis Selektiv agar i mikroaerophilic atmosfære og under særlige bouillon kultur krav44. bLactobacillus iners bør dyrkes på 5% Kanin-BAP plader og NYCIII bouillon i mikroaerophilic atmosfære. cLactobacillus spp. kan dyrkes på MRS under mikroaerfile forhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> Figur 2: Genomisk DNA-ekstraktion agarose gel billeder. Repræsentative gelbilleder, der skildrer gDNA-udvindingsresultater. (A) Lane 1: 1 kb stige, Lane 2: intakt gDNA repræsenterer vellykket udvinding, Lane 3: udtværing angiver fragmenteret gDNA. (B) Vognbane 1: 1 kb stige, Vognbane 2 &3: rRNA forurening betegnet med to bånd mellem 1,5 kb og 3 kb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> Figur 3: Arbejdsgang for hybridgenomassembly. Skema over trin fra læsekvalitetskontrol og forudbehandling til assemblyanmærkning. Læs trimning fjerner tvetydige og aflæsse af lav kvalitet. Q-score- og længdeparametre er angivet og repræsenterer de læsninger, der bevares. Assembly bruger både korte og lange læser til at generere en hybrid de novo genom samling. Montagekvalitet evalueres ud fra fuldstændighed og korrekthed ved hjælp af angivne værktøjer og parametre. Den endelige genomsamling kommenteres for alle gener og specifik loci af interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> Figur 4: Vejledning ibiblioteksstruktur for bioinformatik. Et skema over anbefalet mappe- og filorganisation til behandling af korte og lange læsninger, hybridassembly og genomanmærkning og QC. Vigtige kommandolinjedatabehandlingstrin fremhæves ud for tilsvarende filer og mapper. Fremkalde kommandoer og flag (fed), inputfiler (blå), outputfiler eller mapper (rød), brugerinput, f.eks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> Figur 5: Genomsamlingsgrafer af Bandage. Repræsentativt komplet genomsamlingsgrafer af (A) Klebsiella oxytoca KoPF10 og (B) Klebsiella pneumoniae KpPF25 og ufuldstændig genomsamling af (C) Klebsiella pneumoniae KpPF46. Det komplette genom af KoPF10 demonstrerer et enkelt lukket kromosom, og kpPF25's komplette genom består af et lukket kromosom og fem lukkede plasmider. KpPF46's ufuldstændige kromosom består af to indbyrdes forbundne sammenhængende sammenhængende. Unicycler hybrid de novo assembly genererer en samlingsgraf, der visualiseres af Bandage. Samlingsgrafen indeholder et forenklet skema over genomet, der angiver lukket kromosom eller plasmider af en linker, der forbinder to ender af en enkelt kontig. Tilstedeværelsen af mere end ét sammenkoblet sammenhængende antal angiver ufuldstændig samling. Contig størrelse og dybde kan bemærkes i Bandage så godt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> Figur 6: Komplette genomkort over kommenterede hybridsamlinger. Assemblykort genereret af Geneious Prime for det komplette genom af (A) K. oxytoca KoPF10 og (B) K. pneumoniae KpPF25, der viser kommenterede gener betegnet med farvede pile langs plasmid rygraden. Kromosomer viser kun rRNA og tRNA gener for enkelhed. Genomanmærkninger blev udført ved hjælp af Prokka som angivet i afsnit 10 i denne protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> Tabel 1: Repræsentant Klebsiella spp. Assemblyparametre for K. oxytoca-stammen KoPF10 og K. pneumoniae stamme KpPF25. Tiltrædelsesnumre for de deponerede data om NCBI leveres. Antallet af aflæsninger både før og efter trimning er angivet for begge sekventeringsteknologier. N50 er kun til rådighed for lange læser, da korte læser er af en kontrolleret længde. Plasmid replicon forudsagt ved hjælp af PlasmidFinder v2.1 Enteroebacteriaceae database med parametre indstillet til 80% identitet og 60% længde. en MLST, Multilocus-sekvenstype. b CDS, kodningssekvenser. c Plasmid replicon forudsagt ved hjælp af PlasmidFinder v2.1 Enterobacteriaceae database med parametre indstillet til 80% identitet og 60% længde. d Oxford Nanopore Technologies (ONT) deponerede læsedata. e Illumina deponerede læsedata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies at JoVE.com

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Denne protokol beskriver en omfattende tilgang til dyrkning, sekventering, og de novo hybrid genom samling af urinbakterier. Det giver en reproducerbar procedure for generering af komplette, cirkulære genomsekvenser, der er nyttige til at studere både kromosomale og ekstrakromosomgene genetiske elementer, der bidrager til urinkolonisering, patogenese og antimikrobiel resistensformidling.

Hybrid De Novo Genom Assembly til generering af komplette genomer af urinbakterier ved hjælp af kort- og langlæste sekventeringsteknologier

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

Denne omfattende protokol instruerer, hvordan man genererer tætte genomer af forskellige urinbakterier og gør det muligt for læsere uden kodningserfaring at implementere terminalbaseret genomsamling og analyserørledninger. Komplette genomsamlinger gør det muligt at opdage gener, der bidrager til kolonisering og virulens blandt commensale og uropatogene bakterier. Nære genomer giver indsigt i genomarkitektur og mobile genetiske elementer.Hybridgenomassembedmetoden kan anvendes på alle kultérbare bakterier, der er isoleret fra andre anatomiske steder eller miljømæssige nicher for at give lignende indsigt i genomindhold og arkitektur. Følg protokollen og producentens guide for at forberede en dobbeltstrenget DNA-pool og fortsætte med at rydde op ved at tilføje 2,5 gange mængden af paramagnetiske perler til DNA-poolen, og derefter forsigtigt svirp røret for at blande indholdet. Drej kortvarigt prøven ved 2.000 gange G, og prøven anbringes på en rotator i fem minutter ved stuetemperatur, hvorefter perlerne pellet på magneten.Vask derefter pellet to gange med 250 mikroliter frisklavet 70% ethanol i nucleasefrit vand uden at forstyrre pellet. Lad røret stå på magneten under vask. Aspirat ethanol efter hver vask, derefter kortvarigt spinde ned prøven på 2.000 gange G, før du returnerer den til magneten.Pipette off resterende ethanol og lad pellet tørre i 30 sekunder. Når den er tørret, skal du genbruge pelleten i 60 til 70 mikroliter nukleasefrit vand og inkubere prøven ved stuetemperatur i to minutter og derefter pille prøven på magneten, indtil eluten er klar. Elute overføres til et rent 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.Kvantificer den koncentrerede dobbeltstrengede DNA-pulje ved hjælp af et fluorometer, og forbered derefter en aliquot på 700 nanogram af prøven i 65 mikroliter endelige volumen for at gå videre til adapter ligation trin og bevare resten af puljen på fire grader Celsius for en anden kørsel efter den første kørsel er færdig. Fortsæt med adapter ligation i henhold til producentens anvisninger. Hvis du vil fortsætte med sekventering, skal du blande primingbuffere og prime flowcellen.Forbered DNA-biblioteksløsningen, og læg prøven dropwise på lasteporten. Start rækkefølgen. Åbn driftssoftwaren til rækkefølge, og klik på startknappen, og skriv derefter et navn til eksperimentet.Gå til at fortsætte med at kit udvælgelse for at vælge den relevante bibliotek prep kit og stregkode ekspansion pack bruges og derefter klikke på fortsætte med at køre muligheder. Hvis du planlægger at forberede et tilstrækkeligt bibliotek til en anden kørsel, skal du justere kørelængden fra standard 72 timer til 48 timer og fortsætte med at basere opkald. Kontroller indstillingen basecalling i config fast basecalling.Indstil stregkode til aktiveret, så output FASTQ vil blive trimmet fra stregkode sekvenser og af-multiplexed i separate mapper baseret på stregkode. Klik videre fortsætte med at output. Vælg derefter, hvor outputsekvenseringsdata skal gemmes.Forvent mellem 30 og 50 gigabyte data, hvis der kun gemmes FASTQ-output og mere end 500 gigabyte data, hvis fast5-output gemmes. Hvis du planlægger at fortsætte med manuel filtrering efter rækkefølge, skal du fjerne markeringen af filtreringsindstillingen Qscore syv i læselængde ufiltreret. Ellers skal du lade indstillingen være markeret.Gå for at fortsætte med at køre installationsfanen for at gennemse alle indstillingerne. Hvis indstillingerne er korrekte, skal du klikke på startknappen. Ellers skal du klikke på tilbage for at foretage de nødvendige justeringer.Opret nye mapper for hver stregkode, der bruges i kørslen, i den lange læsermappe. Kopier alle fastq-filer, der svarer til hver stregkode, til den relevante mappe. Kombiner alle fastq-filer for hver stregkode fra hver kørsel.Når filerne er kombineret, skal du åbne terminalen og navigere til stregkodemapperne i den lange læsermappe ved hjælp af cd-kommandoen. Hvis du vil sammenkæde alle fastq-filer pr. stregkode til en enkelt fastq-fil, skal du udføre kommandoen og gentage proceduren for hver stregkode. Brug NanoStat til at vurdere prøvens læsekvalitet ved at udføre kommandoen og derefter registrere resultaterne ved at kopiere outputtet til en tekst- eller Word-fil til fremtidig reference.Når resultaterne er gemt, skal du bruge NanoFilt til at filtrere MinION-læsninger, kassere læsninger med Q mindre end syv og længden mindre end 200 ved at udføre kommandoen. Kør NanoStat med kommandoen på den genererede trimmede fil. Registrer resultaterne ved at kopiere outputtet til en tekst- eller Word-fil, og sammenlign med de tidligere resultater for at sikre, at filtreringen lykkedes.Gentag trinnene for hver stregkode, der bruges i sekvenseringskørslen. Til generering af hybridgenomassembly skal du organisere de kortlæste filer og lange læsefiler i en enkelt mappe med navnet trimmed_reads. Så mappen indeholder en tidligere genereret fastq.gz fil til trimmet lange læser og to fastq. gz filer som R1 og R2 for trimmet korte læser. Gå til den mappe, trimmed_reads, der gemmer læsefilerne ved hjælp af cd-kommandoen i terminalen.Når du er i den rigtige mappe, skal du zip de to kortlæste filer, der skal gemmes i fastq. gz-format ved at udføre kommandoen. Gentag trinnet for både R1 og R2. Sørg for, at alle de læste filer er i fastq.gz format og kontrollere, at alle filerne matcher den samme isolere. Start hybridassemblyen ved hjælp af Unicycler ved at køre kommandoen. Når kørslen er fuldført, skal du gennemse unicycleren.logfil for at sikre ingen fejl. Registrer antallet, størrelsen og den fuldstændige eller ufuldstændige status for den genererede kontekst. Hvis der er identificeret ufuldstændige kontekster i Unicycler-logfilen, skal du køre Unicycler igen med fed skrift ved at føje flaget til kommandoen.Åbn Bandage og klik på filen, vælg derefter indlæs graf og vælg samlingen. gfa-fil, der tidligere blev gemt i unicycler_output_directory genereret af Unicycler. Når filen er indlæst, skal du klikke på knappen tegngraf på venstre værktøjslinje og vurdere, om assemblyen er fuldført, ved at undersøge, hvordan kontigerne er tilsluttet og organiseret.Naviger i terminalen til den mappe, der gemmer Outputtet Unicycler ved hjælp af cd-kommandoen. Kør derefter quast-protokollen ved at udføre kommandoen. Gennemse de rapporter, der genereres af quast i outputmappen quast_output_directory.Naviger i terminalen til den mappe, der gemmer Outputtet Unicycler ved hjælp af cd-kommandoen, og kør derefter prokka ved at udføre kommandoen. Gennemse anmærkningerne ved at åbne tsv-tabellen og ved at uploade den gff-fil, der genereres til sekvensanalysesoftwaren. Visualiser og analyser anmærkningerne i softwaren.I de repræsentative gelbilleder afbildes genomisk DNA eller gDNA-ekstraktionsresultater. Vellykket udvinding og adskillelse af intakt gDNA kan observeres. Mislykket udvinding, der viser fragmenteret gDNA- og RNA-forurening, er også afbildet.Genomsamlingsgraferne af bakterier blev genereret af Unicycler hybrid de novo assembly og visualiseret af Bandage. Det komplette genom af Klebsiella oxytoca KoPF10 demonstrerede et enkelt lukket kromosom, og det komplette genom af Klebsiella pneumoniae KpPF25 bestod af et lukket kromosom og fem lukkede plasmider. Det ufuldstændige kromosom af Klebsiella pneumoniae KpPF46 bestod af to sammenkoblede snoet.Samlingen kort genereret af Geneious Prime for den komplette genom af Klebsiella oxytoca KoPF10 og Klebsiella pneumoniae KpPF25 viser kommenterede gener betegnet med farvede pile langs plasmid rygraden. For at sikre, at indlæsningen af flowceller lykkes, skal du filtrere lange læsninger ved hjælp af de anbefalede indstillinger og sikre, at alle filer er i fastq. gz format.Kør den korrekte Unicycler-kommando ved hjælp af filer, der tilhører det samme eksempel.

Hybrid De Novo Genom Assembly til generering af komplette genomer af urinbakterier ved hjælp af kort- og langlæste sekventeringsteknologier

Abstract