עבודה זו נתמכה על ידי מענק סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור ועדת השימוש בפסטר במכון ועל ידי משרד החקלאות הצרפתי מס ' 2016-0022. כל השלבים מבוצעים בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות.
1. הכנת ריאגנטים וחומרים לפולחן אורגנוידים במעיים
<ol><li>כדי להכין מדיום תרבות גדילה, לערבב מתקדם DMEM / F-12 בתוספת 1x גלוטמין, 1...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

עבודה זו מספקת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבודד קריפטות jejunal murine, תרבית אותם לתוך organoids 3D, ולנתח ROS organoids על ידי שילוב בדיקה פלואורוגנית רגישה ROS עם הדמיה מיקרוסקופית איכותית של organoids שלמים ומדידת ROS כמותית באמצעות cytometry זרימה על תאים בודדים בעקבות דיסוציאציה organoid.
הצעד הקריטי הר?...

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים התאי. הם יכולים גם להיות מיוצרים באופן פעיל על ידי קומפלקסים אנזימטיים מיוחדים כגון NADPH-Oxidases הקשורים לממברנה (NOX) ו Oxidases כפול (DUOX), אשר מייצרים אניון סופראוקסיד ומי חמצן1. על ידי הבעת אנזימים נוגדי חמצון ואוכלי נבלות ROS, תאים יכולים לכוונן דק את איזון ה- redox שלהם, ובכך להגן על הומאוסטזיס רקמות2. למרות ROS יכול להיות רעיל מאוד לתאים ולפגוע DNA, חלבונים, שומנים, שומנים, הם מולקולות איתות חיוני2. באפיתל המעיים, רמות ROS מתונות נדרשות להתפשטות תאי גזע ואבות אבות3; רמות ROS גבוהות להוביל אפופטוזיס שלהם4. עקה חמצונית כרונית קשורה למחלות רבות במערכת העיכול, כגון מחלות מעי דלקתיות או סרטן. כדוגמה, במודל עכבר של סרטן מעיים מונחה Wnt, ייצור ROS מוגבר באמצעות הפעלה של NADPH-oxidases נמצאה כנדרשת עבור תאים סרטניים hyperproliferation5,6. הגדרת האופן שבו תאי מעיים, בפרט תאי גזע, תאי גזע מנהלים עקה חמצונית וכיצד הסביבה התאית יכולה להשפיע על יכולת זו חיונית כדי להבין את האטיולוגיה של מחלה זו טוב יותר7.
ברקמה, סוגי תאים שונים מציגים מצב חמצוני בסיסי שעשוי להשתנות בהתאם לתפקודם ולחילוף החומרים שלהם ולביטוי של רמות משתנות של מולקולות חמצון ונוגדי חמצון4,7. ניטור ROS ב vivo הוא מאתגר מאוד. צבעים חדירים לתאים הפולטים פלואורסצנטיות בהתאם למצבם האדום פותחו כדי לדמיין ולמדוד ROS תאי בתאים חיים ובבעלי חיים. עם זאת, היעילות שלהם תלויה בפיזור שלהם בתוך רקמות חיות ואת הקריאה המהירה שלהם, מה שהופך אותם קשים לשימוש במודלים של בעלי חיים8.
בעבר, המחקר של ההשפעה של תרכובות על דור ROS נעשה באמצעות קווי תאים, אבל זה לא יכול לשקף את המצב in vivo . מודל האורגנויד במעיים, שפותח על ידי קבוצת Clevers9, מאפשר את הצמיחה של תאים ראשוניים במעיים ex vivo. תרבות של קריפטות מעיים במטריצות, בנוכחות גורמי גדילה מוגדרים, מובילה למבנים תלת-ממדיים, הנקראים אורגנוידים (מיני-מעיים), אשר משחזרים את ארגון הקריפטה-וילון, עם תאים משושלות האפיתל השונות המצפות לומן פנימי, ותאי הגזע במעיים המתגוררים בבליטה קטנה דמוית קריפטה.
כאן, תוך ניצול מודל זה, מתוארת שיטה פשוטה לחקר עקה חמצונית בתאי מעיים ראשוניים ברזולוציה של תא יחיד על ידי הוספת צבע רגיש ל- ROS זמין מסחרית למדיום התרבות האורגנויד.
קוראי לוחות משמשים לעתים קרובות כדי לזהות ייצור ROS באוכלוסייה הכוללת. פרוטוקול זה משתמש בציטומטריית זרימה או בבדיקת הדמיה כדי לזהות ROS בסוג תא מסוים עם תאים מהונדסים גנטית או כתמי נוגדנים ספציפיים. עבודה זו כוללת תרבות אורגנויד מעיים של עכבר והדמיה ROS על ידי הדמיה קונפוקלית וכימות על ידי ציטומטריית זרימה. באמצעות Lgr5-GFP עכברים נגזרים אורגנוידים מעיים קטנים, ניתן לנתח באופן ספציפי את רמת הלחץ החמצוני בתאי גזע מעיים על טיפולים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבדוק את ההשפעה של מולקולות אקסוגניות, כגון מראמיל-dipeptide נגזר מיקרוביוטה (MDP)10, על מאזן ROS, לאחר גירוי organoids עם התרכובות שנבחרו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

מינים חמצן תגובתי (ROS) לשחק תפקידים חיוניים הומאוסטזיס מעיים. ROS הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים של התא. הם מיוצרים בתגובה לזיהום או פציעה ברמה הרירית כפי שהם מעורבים בתגובות מיקרוביאלית וריפוי פצעים. הם גם שליחים משניים קריטיים, ויסות מספר מסלולים, כולל צמיחת תאים ובידול. מצד שני, רמות ROS מוגזמות להוביל עקה חמצונית, אשר יכול להיות מזיק לתאים לטובת מחלות מעיים כמו דלקת כרונית או סרטן. עבודה זו מספקת שיטה פשוטה כדי לזהות ROS באורגנוידים מורין מעיים על ידי הדמיה חיה וציטומטריית זרימה, באמצעות בדיקה פלואורוגנית זמינה מסחרית. כאן הפרוטוקול מתאר את ההשפעה של תרכובות המווסתות את איזון redox באורגנוידים במעיים ולזהות רמות ROS בסוגי תאי מעיים ספציפיים, המודגמים כאן על ידי ניתוח של תאי גזע מעיים המסומנים גנטית עם GFP. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם בדיקות פלואורסצנטיות אחרות.

כהוכחה לרעיון של הפרוטוקול המתואר, הקריפטות שהתקבלו מקו העכבר Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 שימשו שבו תאי גזע מעיים מציגים ביטוי GFP פסיפס, אשר הוקם על ידי בארקר ואח ', כדי לאפיין תאי גזע מעיים10 בתחילה ולאפשר למפות תאים אלה בהתבסס על ביטוי GFP שלהם. מודל מסופק ובכך להשוות את רמות ROS באוכלוסיית סוג ת...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

שיטה זו היא כלי רב ערך בתחום הביולוגיה התאית להערכת רמות ROS הסלולר בתאים ראשוניים חיים מעובדים במבחנה כמו organoids באמצעות בדיקה פלואורוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ROS ניתן לדמיין באופן איכותי באורגנוידים מעיים שלמים על ידי מיקרוסקופיה וניתוח כמותי בתאים מנותקים על ידי cytometry זרימה באמצעות לוחות 96-well. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים organoid אחרים וחיישנים פלואורסצנטיים חלופיים עשויים לשמש לניתוח מסלולים תאיים שונים.לפני החלת פרוטוקול זה בפעם הראשונה, הנסיין צריך להכיר את תרבות האורגנויד ואת passaging. למרות הפרוטוקול שלנו מותאם היטב גישות הקרנה, למתחילים צריך להתחיל עם כמה דוגמאות. מי שתדגים את ההליך תהיה סופי דולארוי, מהנדסת מהמעבדה.לאחר הקרבת עכבר Lgr5-GFP בן 8 עד 10 שבועות, לאסוף חמישה עד שמונה סנטימטרים של אזור jejunum המקיף בין התריסריון לאיליאום, ולהניח אותו DPBS קר בתוספת אנטיביוטיקה על קרח. לאחר מכן, לנקות את התוכן במעיים על ידי שטיפה עם חמישה עד 10 מיליליטר של DPBS קר המכיל אנטיביוטיקה. לאחר מכן באמצעות מספריים קצה כדור, לפתוח את המעי קו אורך, באמצעות מלקחיים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי המכילה DPBS קר עם אנטיביוטיקה.לנער את הרקמה בתוך הצלחת כדי לשטוף אותו. לאחר מכן, לתפוס את המעי על ידי שאיפה באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 10 מיליליטר קר 10 מילימולר EDTA. הפוך את הצינור שלוש פעמים ודגר אותו על קרח במשך 10 דקות.לאחר הדגירה, להעביר את הרקמה בצינור המכיל 10 מיליליטרים של DPBS ומערבולת במשך שתי דקות. מיד להוסיף 10 microliters של השבר בצלחת פטרי ולהשתמש מיקרוסקופ כדי להעריך את איכות השבר. לאחר שתי העברות ב- DPBS המכילות צינורות עם מערבולת של שתי דקות בין כל העברה, לדגור על המעי ב- EDTA על קרח במשך חמש דקות כפי שהוכח בעבר.לאחר שלוש העברות רצופות בצינורות המכילים DPBS עם מערבולת של שלוש דקות בין כל העברה, לשלב את השברים הטובים ביותר לתוך צינור 50 מיליליטר על ידי היפוך הצינורות שנבחרו שלוש פעמים סינון דרך מסננת תא 70 מיקרון. ואז לסובב את הקריפטות, להשליך את supernatant ולשבש את הכדור באופן מכני לפני הוספת חמישה מיליליטרים של DMEM F12 קר. ספרו את מספר הקריפטות הקיימות ב-10 מיקרוליטרים באופן ידני מתחת למיקרוסקופ.לאחר הספירה, לסובב את הקריפטות שוב ולהסיר בזהירות את supernatant. לאחר מכן באופן מכני לשבש את הכדור ולהוסיף תרבות צמיחה מדיום לצינור כדי לקבל ריכוז של 90 קריפטות לכל microliter. לאחר מכן, להוסיף שני כרכים של מטריצת ממברנת מרתף לא מדוללת או BMM כדי לקבל ריכוז סופי של 30 קריפטות לכל מיקרוליטר ובזהירות pipette המתלה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.לניתוח ציטומטריית זרימה, צלחת 10 מיקרוליטרים של קריפטות BMM לערבב ככיפה במרכז כל באר של צלחת 96-well תחתית 96-well מחומם מראש. ולהדמיה, להפקיד 10 מיקרוליטרים של התערובת כשכבה דקה בתא מיקרו-מפולת שמונה בארות שחומם מראש. לאחר מתן אפשרות ל- BMM להתמצק בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, מניחים את הצלחות באינקובטור ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.לאחר 15 דקות, מוסיפים 250 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לתוך כל באר, מקפידים לא לנתק את ה- BMM, ומניחים את הצלחת באינקובטור. כדי לדמיין עקה חמצונית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי n-אצטילציסטאין בבארות המתאימות של microslide שמונה בארות תא היטב מצופה organoids. לאחר דגירה של שעה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי טרט-בוטיל הידרופרוקסיד בבארות המתאימות ודגורים במשך 30 דקות נוספות.לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של דילול 1.25 מילימולרי של הבדיקה פלואורוגנית לכל באר, ואחריו מיקרוליטר אחד של 1.25 מיליגרם לפתרון Hoechst מיליליטר. לאחר דגירה נוספת של 30 דקות, הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM והוסף בעדינות 250 מיקרוליטרים של DMEM חם ללא אדום פנול. דמיינו את האורגנוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא תרמי ובאספקת גז המזהה את הגשוש הפלואורוגני.באמצעות הפקד החיובי, הגדר את עוצמת הלייזר ואת חשיפת הזמן עבור אות ROS, ובדוק כי אות זה נמוך יותר בפקד השלילי. לאחר מכן, באמצעות עין, לסנן את השקופית כדי לזהות את organoids מבטא GFP ולהתאים את עוצמת הלייזר. הגדר z-stack של 25 מיקרומטר והגדר עמדות כדי לקבל תמונה תפורה של האורגנויד כולו כדי לקבל קטע של organoids מראה שכבה אחת של תאים.הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מניית n-אצטילציסטאין בבארות הבקרה השליליות של הצלחת התחתונה העגולה בת 96 הבאר המכילה את האורגנוידים. לאחר דגירה של שעה, מוסיפים תמיסת מלאי מיקרו-בוטיל הידרופרוקסיד אחת בבארות המתאימות ודגורים במשך 30 דקות. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, להסיר את המדיום מבלי להפריע BMM המצורף ולהעביר אותו לצלחת תחתונה עגולה אחרת 96 היטב.שמור את הצלחת הזאת בצד. לאחר מכן, להוסיף 100 מיקרוליטרים של טריפסין ושימוש פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להרוס את BMM. לאחר דגירה קצרה של חמש דקות, נתק את האורגנוידים על ידי צנרת למעלה ולמטה בפעם השנייה.לסובב את הצלחת ולהשליך את supernatant על ידי היפוך הצלחת. הוסף את המדיום שנאסף בעבר בצלחת אחרת של 96 בארות בחזרה לבארות המתאימות והחזר את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של הגשוש הפלואורוגני ודגרים במשך 30 דקות.לאחר מכן לסובב את הצלחת שוב ולהחזיר את התאים עם 250 מיקרוליטרים של פתרון DAPI. העבר את הדגימות בצינורות ציטומטריה זורמים ולשמור את הצינורות על קרח. מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה וצד על שליטה בלתי מוכתמת ומתחי לייזר עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות חד-מוכתמות.לאחר מכן באמצעות אסטרטגיית gating מתאימה, לאסוף מינימום של 20,000 אירועים. תמונות קונפוקליות מייצגות של כתמי ROS ואורגנוידים הראו כי בנוכחות מעכב NAC, רק האות מהתאים המתים הכלולים בלומן של האורגנויד נראה לעין. באורגנויד שאינו מטופל, ניתן לראות את רמות ה- ROS הבסיסיות, במיוחד בתאים חיוביים GFP, המוכיחים כי תאי גזע מייצרים ROS גבוה יותר מאשר תאים מובחנים.תאים חיוביים GFP מציגים אות ציטופלסמי משמעותי יותר עם התמריץ בנוכחות הבדיקה הפלואורוגנית, המוכיח כי רמות ROS להגדיל במיוחד בתאי גזע לאחר הטיפול. ניתוח ציטומטריה זרימה של ייצור ROS באורגנוידים במעיים מראה כי רמות ROS הבסיסי להקטין לאחר גירוי עם מעכב ולהגדיל לאחר אתגר עם תמריץ. תאים מטופלים מראש עם מעכב ולאחר מכן מגורה עם ממריץ להציג רמות נמוכות יותר מאשר אלה מגורה עם ממריץ בלבד.ניתוח דומה על תאי גזע מגודרים כמו GFP חיובי מראה ירידה של פי 3.5 ברמת ROS על טיפול מעכב ועלייה פי ארבעה על טיפול ממריץ על תאים שאינם מגורה. בעת ניסיון הליך זה, משתמשים צריכים לזכור להגביל את הלחץ התא במהלך מניפולציה אורגנויד ודיסוציאציה. בנוסף, תמיד יש לכלול פקדים חיוביים ושליליים בעת ניתוח ROS.בעקבות הליך זה, ניתן להשלים את הניתוח על ידי כתמים immunofluorescence על אורגנוידים שלמים קבועים, מיון תאים, וניתוח ביטוי גנים כדי לקבל תובנות נוספות על ויסות ROS. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך לדעת איך לגדל אורגנוידים מעיים מורין, לבצע ניתוח הדמיה חיה של organoids שלם, ולעבד איברי מעיים לניתוח ציטומטריה זרימה.

ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

Abstract