Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

Метилирование ДНК, форма эпигенетической регуляции генов, важно для нормальной клеточной функции. В клетках белки, называемые ДНК-метилтрансферазами (DDNMT), устанавливают и поддерживают паттерн метилирования ДНК. Изменения в нормальном паттерне метилирования ДНК связаны с развитием и прогрессированием рака, что делает DDNMT потенциальными мишенями для лекарств от рака. Таким образом, выявление и характеристика новых низкомолекулярных ингибиторов этих ферментов имеет большое значение. В этой статье представлен протокол, который может быть использован для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы. Непрерывный связанный кинетический анализ позволяет определить начальные скорости метилирования ДНК в присутствии и отсутствии потенциальных ингибиторов малых молекул. Анализ использует метил-чувствительную эндонуклеазу Gla I для соединения метилирования гемиметилированного субстрата ДНК с генерацией флуоресценции.

Этот непрерывный анализ позволяет контролировать активность ферментов в режиме реального времени. Проведение анализа в небольших объемах в микротитрных пластинах снижает стоимость реагентов. Используя этот анализ, был проведен небольшой пример скрининга для ингибиторов DNMT1, наиболее распространенного изофермента DNMT у людей. Высокозамещенный натуральный продукт антрахинона, лаккаевая кислота А, является мощным, конкурентоспособным по ДНК ингибитором DNMT1. Здесь мы исследуем три потенциальных ингибитора малых молекул — антрахиноны или антрахиноподобные молекулы с одним-тремя заместителями — в двух концентрациях, чтобы описать протокол анализа. Начальные скорости используются для расчета процентной активности, наблюдаемой в присутствии каждой молекулы. Одно из трех исследованных соединений демонстрирует концентрационно-зависимое ингибирование активности DNMT1, что указывает на то, что оно является потенциальным ингибитором DNMT1.