Vi anerkender den økonomiske støtte fra Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 og Department of Science and Technology til projektet GAP165 for at støtte det arbejde, der præsenteres i dette manuskript. Vi takker Jeyashri Rengaraju og Chetan Mishra for deres hjælp med eksperimenter.

Zebrafiskforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med den institutionelle dyreetiske godkendelse (IAEC) fra CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Indien (forslag nr. 45a). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere dyrenes lidelser.
1. Injektion af morpholino i zebrafiskembryoner
<ol><li>Brug en standard nåletrækker til at tegne meget skarpe og lukkede pipetter.</li>
	<li>Opløsningen indeholdende morpholino lægges i mikropipetterne ved hjælp...

<ol>
	<li>Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+evolution+of+pigment+patterns+in+fish.">Genetics and evolution of pigment patterns in fish.</a> Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).</li><li>Jablonski, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+human+skin+and+skin+color.">The evolution of human skin and skin color.</a> Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).</li><li>Hoekstra, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics,+development+and+evolution+of+adaptive+pigmentation+in+vertebrates.">Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates.</a> Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).</li><li>Quigley, I. K., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+pattern+formation+in+zebrafish:+a+model+for+developmental+genetics+and+the+evolution+of+form.">Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form.</a> Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).</li><li>Meyers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+development+of+a+vertebrate+model+organism.">Zebrafish: development of a vertebrate model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19 (2018).</li><li>Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+melanophore+development+in+zebrafish+embryos.">Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).</li><li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development:+insights+from+the+zebrafish.">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).</li><li>Carney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+role+for+Sox10+in+specification+of+neural+crest-derived+sensory+neurons.">A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons.</a> Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).</li><li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neural+crest+by+regulation+of+Mitf.">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf.</a> Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).</li><li>Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fugu+tyrp1+promoter+directs+specific+GFP+expression+in+zebrafish:+tools+to+study+the+RPE+and+the+neural+crest-derived+melanophores.">The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores.</a> Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).</li><li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+into+zebrafish+embryos.">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li><li>Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+for+efficient+gene+delivery.">Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery.</a> Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).</li><li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish.">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), 1007000 (2017).</li><li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing+in+generating+mouse/zebrafish+models+of+human+skeletal+diseases.">The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).</li><li>Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+eumelanin+and+pheomelanin+markers+in+diverse+biological+samples+by+HPLC-UV-MS+following+solid-phase+extraction.">Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction.</a> PLoS One. 14 (10), 0223552 (2019).</li><li>Fernandes, B., Matam&#225;, T., Guimar&#227;es, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+quantification+of+melanin.">Fluorescent quantification of melanin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).</li><li>Hultman, K. A., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+direct-developing+and+stem+cell-derived+melanocytes+to+the+zebrafish+larval+pigment+pattern.">Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern.</a> Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).</li><li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease.">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142 (4), 620-632 (2015).</li></ol>

Pigmenteringsfænotype manifesteres ofte som ændringer i indholdet af melanin eller antallet af pigmentbærende melanocytter. Den metode, der er beskrevet heri, gør det muligt at diskonservere denne dikotomi og tillader både kvalitativ og kvantitativ vurdering af melaninindholdet og antallet af melanoforer pr. embryon, uanset melaninindholdet. Zebrafiskens høje frugtbarhed, pigmenterede melanocytters synlige natur og mangel på melanosomoverførsel muliggør dissektion af melanocytbiologi ved hjælp af denne omvendte...

Mens brugen af melanin til fotobeskyttelse har udviklet sig flere gange på tværs af dyreriget, har hvirveldyr tilsyneladende perfektioneret processen. Dedikerede pigmentproducerende celler med et omfattende maskineri til syntetisering og indhold af melanin bevares fra fisk til mennesker1. Resultatet af pigmentering er imidlertid dramatisk varieret, lige i farven til recipience og præsenterer som levende mønstre på integreringer, hud og hår2. På trods af mangfoldigheden er repertoiret af gener, der er involveret i pigmenteringsrespons, slående bevaret. Kernekomponenterne i melaninsyntetiseringsmaskineriet, såsom de vigtigste melaninsyntetiserende enzymer, komponenterne i melanosomerne og opstrømsforbindelsen til signalvejen, forbliver i det væsentlige identiske på tværs af organismer. Subtile genetiske forskelle medfører dramatiske ændringer i pigmenteringsmønstrene observeret på tværs af arter3. Derfor giver en omvendt genetisk tilgang i en lavere hvirveldyrorganisme, zebrafisken (Danio rerio), en glimrende mulighed for at dechifrere involveringen af gener i gengivelsen af pigmenteret tilstand4.
Zebrafiskembryoner udvikler sig fra en encellet befrugtet zygote til en larve inden for et tidsrum på ~ 24 timer efter befrugtning (hpf)5. Påfaldende nok er de melanocytækvivalente celler - melanoforerne - store celler, der er til stede i dermis og er iøjnefaldende på grund af det mørke melaninindhold6. Disse neurale kamafledte celler udstråler ~ 11 hpf og begynder at pigmentere ~ 24 hpf 6,7. Konserverede genekspressionsmoduler har gjort det muligt at identificere nøglefaktorer, der orkestrerer melanocytfunktioner og ført til udviklingen af transgene fluorescerende reporterlinjer Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) og Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10, der mærker selektive stadier af melanocytudvikling. Brug af disse transgene fiskelinjer muliggør forhør af cellebiologi af melanocytter på organismeniveau i vævskonteksten med passende signaler i henhold til udviklingstidslinjerne. Disse reportere supplerer pigmentbaseret kvantificering af melanocytter og muliggør en særskilt vurdering af melanocyttal uanset melaninindhold.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol til dekryptering af melanocytternes biologi ved at vurdere to kritiske parametre, nemlig melaninindhold og melanocyttal. Mens førstnævnte er en almindelig funktionel aflæsning, der stammer fra et hypopigmenteringsrespons, er sidstnævnte forbundet med en reduktion i specifikationen eller overlevelsen af melanocytter og er ofte forbundet med genetiske eller erhvervede depigmenteringsbetingelser. Den overordnede strategi for denne omvendte genetiske skærm er at tavse udvalgte gener ved hjælp af en morpholino og undersøge de melanocytspecifikke resultater. Melaninindhold analyseres ved hjælp af billedbaseret kvantificering af gennemsnitlige grå værdier efterfulgt af bekræftelse ved hjælp af et melaninindholdsassay. Antallet af melanocytter på forskellige modningsstadier analyseres ved hjælp af billedbaseret kvantificering og bekræftes yderligere ved anvendelse af FACS-analyse. Her demonstreres screeningsprotokollen ved hjælp af to kandidatgener, nemlig kulsyreanhydrase 14, der er involveret i melanogenese, og en histonvariant H2AFZ.2, der er involveret i specifikationen af melanocytter fra neurale kamforløberpopulationen. Mens førstnævnte ændrer melaninindholdet og ikke melanocyttallene, ændrer sidstnævnte antallet af specificerede melanocytter og følgelig melaninindholdet i embryoet. Alt i alt giver denne metode en detaljeret protokol til at identificere et kandidatgens rolle i pigmentering og skelne dets rolle i at kontrollere melanocyttal versus melaninindhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-A</td>
			<td>For preparing MO solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>For washing steps in FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-9539-500G</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>NA</td>
			<td>For cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td>For making single cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5648</td>
			<td>FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td>to immobilize ZF for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td>For cold lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD-Biosciences</td>
			<td>342065</td>
			<td>FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270</td>
			<td>FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism Software</td>
			<td>Graphstats Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td>For data representation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Software</td>
			<td>National Institute of health</td>
			<td>NA</td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes (1 mL)</td>
			<td>DispoVan</td>
			<td>NA</td>
			<td>For manual dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melanin, Synthetic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8631</td>
			<td>For melanin content assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7027-250G</td>
			<td>to immobilize ZF for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholino</td>
			<td>Gene-tools</td>
			<td>NA</td>
			<td>For knock-down experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>to inhibit melanin formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish (60 mm)</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>460090</td>
			<td>For embryo plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulphonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>For cold lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1099-500mL</td>
			<td>For washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>53702</td>
			<td>For dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>For cold lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath fluid</td>
			<td>BD FACSFlowTM</td>
			<td>342003</td>
			<td>FACS protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Cold lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td>For cold lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1677119</td>
			<td>For trypsinization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse genetic approach to identify regulators of pigmentation using zebrafish

Melanocytter er specialiserede neurale kamafledte celler, der findes i den epidermale hud. Disse celler syntetiserer melaninpigment, der beskytter genomet mod skadelige ultraviolette strålinger. Perturbationer i melanocytfunktion fører til pigmentforstyrrelser såsom piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma og melanom. Zebrafisk er et fremragende modelsystem til at forstå melanocytfunktioner. Tilstedeværelsen af iøjnefaldende pigmenterede melanocytter, let genetisk manipulation og tilgængelighed af transgene fluorescerende linjer letter undersøgelsen af pigmentering. Denne undersøgelse anvender brugen af vildtype og transgene zebrafisklinjer, der driver grønt fluorescerende protein (GFP) ekspression under mitfa - og tyrp1-promotorer , der markerer forskellige stadier af melanocytter. 
Morfolinobaseret hæmning af kandidatgener opnås for at evaluere det fænotypiske resultat på larvepigmentering og kan anvendes til screening for pigmenteringsregulatorer. Denne protokol demonstrerer metoden fra mikroinjektion til billeddannelse og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-baseret dissektion af fænotyper ved hjælp af to kandidatgener, kulsyreanhydrase 14 (Ca14) og en histonvariant (H2afv), til omfattende vurdering af pigmenteringsresultatet. Endvidere demonstrerer denne protokol adskillelse af kandidatgener i melanocytspecificerere og differentiatorer, der selektivt ændrer henholdsvis melanocyttal og melaninindhold pr. Celle.

Arbejdsprocessen beskrevet i figur 1 blev brugt til at udføre morfolin-baseret genetisk forstyrrelse på zebrafiskens encellestadie. Pigmenteringsanalyse blev udført ved hjælp af forskellige metoder, som nævnt nedenfor. For at illustrere de repræsentative resultater blev standardiserede mængder antisense morpholino rettet mod h2afv og ca14 gener injiceret i æggeblommen eller encellestadiet af zebrafiskembryoet. Den indledende fænotypning baseret på brightfield-bill...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish at JoVE.com

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Regulatorer af melanocytfunktioner styrer synlige forskelle i pigmenteringsresultatet. Dekryptering af den molekylære funktion af kandidatpigmenteringsgenet udgør en udfordring. Heri demonstrerer vi brugen af et zebrafiskmodelsystem til at identificere kandidater og klassificere dem i regulatorer af melaninindhold og melanocytantal.

Omvendt genetisk tilgang til at identificere pigmentregulatorer ved hjælp af zebrafisk

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Denne protokol er en sammenlægning af forskellige teknikker, der ville gøre det muligt for forskerne at afgrænse kandidatgenets rolle i melanocytbiologien. Det er en holistisk tilgang til at opnå en logisk slutning. Ved at kombinere forskellige metoder kan forstyrrende faktorer undgås, og det kan hjælpe forskere med at opnå et væsentligt resultat.For at starte analysen immobiliseres de 48 HPF-embryoner med 0,016% tricain. Monter embryonerne ved hjælp af et par milliliter 1,5 til 2% methylcellulose i en petriskål. Vælg embryonerne med en Pasteur-pipette og læg dem i methylcellulose for at begrænse bevægelsen under billeddannelsen.For optimal lateral eller dorsal billeddannelse skal du justere deres position med en forstørrelse på mere end 5X. Placer petriskålen under mikroskopet. Brug en manipulator til at justere fisken, så alle fem melanocytembryonale striber er synlige samtidigt.Brug anskaffelsessoftwaren til at tage billederne. Hvis fisken vågner, skal du placere den i tricainvand, indtil den stabiliseres. Brug det åbne værktøj i ImageJ-softwaren til at åbne det billede, der skal kvantificeres.Vælg frihåndsformværktøjet for at skitsere det område, der skal analyseres. Vælg indstillingen Indstil målinger, klik på den gennemsnitlige grå værdi og derefter på området. For at beregne den gennemsnitlige grå værdi for det valgte område skal du klikke på M eller gå til analysere og vælge måling.Baseret på interessestadiet overføres embryonerne til en petriskål indeholdende 0,6 milligram pr. Milliliter Pronase. Brug en Pasteur-pipette til at overføre de dechorionerede embryoner til en petriskål, der indeholder almindeligt embryovand efter fem til 10 minutter. Med en glaspasteurpipette opsamles og overføres omkring 100 embryoner til et to milliliter mikrocentrifugerør.Kassér mediet og tilsæt 200 mikroliter iskold deyolking Ringers opløsning. Anbring røret på is og bland indholdet ca. 20 gange med en pipette for at opløse åget. Glassene centrifugeres to gange ved 100 G i et minut ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres.Overfør de deyolked embryoner ved hjælp af en milliliter pipette i en petriskål indeholdende 10 ml trypsinopløsning. Bland opløsningen en eller to gange ved hjælp af en milliliter pipette for at reducere aggregeringen. Før den trypsiniserede suspension gennem en 70 mikrometer sil anbragt på et 50 ml konisk rør for at opsamle en enkeltcellesuspension.Vask petriskålene med trypsiniseret suspension for at fjerne de klæbende celler fra overfladen. For at tælle de fluorescerende mærkede celler ved hjælp af et flowcytometer, efter oprettelse af en ny eksperimentmappe, skal du tegne et fremad versus sidespredningsplot. Lav et histogram for intensiteten af fluoresceinisothiocyanat.Indlæs vildtypecellerne først for at indstille spredningsportene fremad og siden og FITC-tærsklen. Derefter indlæses cellerne isoleret fra transgene FTYRP GFP-linjeembryoner for at tælle melanocytterne. Monter embryonerne i 1,5 til 2% methylcellulose i en petriskål.Placer det under mikroskopet og juster det i den ønskede retning ved hjælp af en pipettespids. Brug erhvervelsessoftwaren til at erhverve billederne. For embryoner under 24 HPF ved hjælp af 10X forstørrelse skal du tage hele billedet, mens for embryoner mere end 24 HPF skal du erhverve flere scanningsfelter og derefter samle dem.Efter at have udført analysen afslørede Brightfield-billeddannelsen efter 48 timer tilstedeværelsen af alle fem pigmenterede melanoforstriber. På 48 HPF-stadiet blev antallet af laterale melanoforer beregnet, og det blev konstateret, at histonvarianten h2afv-morfanter viste et reduceret antal melanoforer sammenlignet med kontrollen. Den gennemsnitlige grå værdi blev målt for CA14 og h2afv morfanter, hvilket afslørede, at værdierne var højere for varianterne end kontrolmorfanterne.Ved at anvende en natriumhydroxidbaseret spektrofotometrisk absorptionsmetode blev melaninindholdet kvantificeret, hvor CA14-morfanterne viste mindre indhold end kontrolmorfanterne. Fluorescensbilleddannelse blev udført for at evaluere morfolinobaseret ændring for forskellige stadier af zebrafiskmelanoforudvikling. Antallet af melanoforer i CA14 og h2afv morfanter blev analyseret ved hjælp af FACS.Det blev observeret, at antallet af melanoforer i CA14 forblev uændret, mens de blev signifikant reduceret i h2afv sammenlignet med kontrolmorfanten. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet pr. område blev også beregnet, hvilket viste, at h2afv-morfanterne viser et betydeligt fald i værdien i forhold til kontrolmorfanter. Mens du justerer fisken før billeddannelse, skal du sørge for at visualisere alle fem melanoforstriber.Du skal vippe fisken lidt for at skelne mellem de to laterale striber. Efter at have fastslået et kandidatgens rolle i melanocytudvikling, kan vi eliminere genet på en vævsspecifik måde ved hjælp af CRISPR-teknologi. Det vil være en mere målrettet tilgang.

Omvendt genetisk tilgang til at identificere pigmentregulatorer ved hjælp af zebrafisk

Abstract