Figürler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırma, Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco ve Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. tarafından finanse edilmektedir.

Protokol onaylandı ve tüm hayvanlar Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique'in (Inserm, Fransa) kurumsal yönergelerine göre ele alındı. P8'deki 24 OF1 fare yavrusunun (hem erkek hem de dişi) beyinlerinden mikroglia'nın manyetik izolasyonu, 6 kuyulu, 12 kuyulu veya 96 kuyucuklu plakalara bölünmüş olarak sunulmuştur. Deneysel çalışma, steril koşulları korumak için bir başlık altında gerçekleştirildi.
1. İzolasyon ve hücre kültürü için st...

Mevcut çalışma, manyetik olarak sıralanmış CD11b + hücrelerini kullanarak birincil bir mikroglial hücre kültürü sunmaktadır. Mikroglial fonksiyonel değerlendirmeye (RT-qPCR ve fagositik tahliller) ek olarak, mikroglial kültür saflığı da belirlendi.
Klasik mikroglia hücre kültürleri genellikle P1 veya P2 kemirgen yenidoğan beyninden ve astrositlerle en az 10 gün boyunca ortak kültürden üretilir. Mikroglia daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcı kullanılarak mekanik...

Mikroglia, erken embriyonik gelişim sırasında nöroepitelyuma göç eden yumurta sarısı kesesinin eritropoetik öncüllerinden türetilen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofaj benzeri hücrelerdir1. Bağışıklık fonksiyonlarının yanı sıra, nörogelişim sırasında, özellikle sinaptogenez, nöronal homeostaz ve miyelinasyon2 için önemli bir rol oynarlar. Yetişkinlikte, mikroglia çevreyi sürekli taramak için uzun hücresel süreçler geliştirir. Beyin hasarı veya beyin hastalığı gibi homeostaz rüptürleri durumunda, mikroglia morfolojik görünümlerini amip şeklini benimsemek, yaralı bölgeye göç etmek, birçok sitoprotektif veya sitotoksik faktörü artırmak ve serbest bırakmak için değiştirebilir. Mikroglia, gelişim evrelerine ve devam eden yaralanma tipine bağlı olarak heterojen aktivasyon durumlarına sahiptir 3,4,5. Bu çalışmada, bu aktivasyon durumları genel olarak üç farklı fenotipte sınıflandırılmıştır: pro-enflamatuar / fagositik, anti-enflamatuar ve immüno-düzenleyici, gerçekte durumundaha karmaşık olması muhtemel olduğunu akılda tutarak6.
Beyin gelişiminin erken aşamalarında in vivo mikroglial aktivasyonu ve nöroprotektif stratejilerin taranmasını incelemek, (1) sütten kesilmeden önce hayvanların kırılganlığı ve (2) mikroglial hücrelerin sayısının az olması nedeniyle zor olabilir. Bu nedenle, mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar toksisite 7,8,9, nöroprotektif stratejiler5,10,11,12,13,14 ve ko-kültürler 15,16,17,18,19,20,21 için yaygın olarak kullanılmaktadır. . In vitro çalışmalar mikroglial hücre hatlarını, kök hücre kaynaklı mikrogliayı veya birincil mikroglia kültürünü kullanabilir. Tüm bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları vardır ve seçim ilk biyolojik soruya bağlıdır. Birincil mikroglia kültürlerini kullanmanın faydaları, homojen genetik arka plan, patojensiz öykü ve hayvan ölümünden sonra mikroglianın uyarıldığı zamanın kontrolüdür22.
Yıllar geçtikçe, hem yenidoğan hem de yetişkin 23,24,25,26,27,28,29 kemirgenlerinden birincil mikroglia kültürlenmesi için farklı yöntemler (akış sitometrisi, sallama veya manyetik etiketleme) geliştirilmiştir. Bu çalışmada, fare yenidoğan yavrularından mikroglia izolasyonu, mikroboncuk kaplı anti-fare CD11b25,27,29 kullanılarak daha önce tarif edilen manyetik aktive hücre sıralama teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. CD11b, mikroglia da dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir integrin-reseptörüdür. Beyinde enflamatuar bir zorluk olmadığında, neredeyse tüm CD11b + hücreleri mikroglia30'dur. Daha önce yayınlanmış diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 23,24,25,26,27,28,29, mevcut protokol acil ex vivo mikroglial aktivasyon analizlerini ve yaygın in vitro primer mikroglial kültürü dengelemektedir. Bu nedenle, mikroglia (1) doğum sonrası günde (P) 8'de miyelin çıkarılması olmadan izole edilir, (2) serum olmadan kültürlenir ve (3) beyin izolasyonundan sadece 48 saat sonra siRNA, miRNA, farmakolojik bileşik ve / veya enflamatuar uyaranlara maruz kalır. Bu üç yönün her biri, mevcut protokolü alakalı ve hızlı hale getirir. Her şeyden önce, pediatrik mikroglia kullanımı, in vitro mikroglial reaktiviteyi potansiyel olarak değiştirebilecek ek bir demiyelinizasyon adımı gerektirmeden kültürde dinamik ve reaktif canlı hücrelerin elde edilmesini sağlar. Mevcut protokol, mikroglia'nın fizyolojik ortamına mümkün olduğunca yaklaşmayı amaçlamaktadır. Gerçekten de, mikroglia asla serum ile karşılaşmaz ve bu protokol de serum kullanımını gerektirmez. Dahası, mikroglia'yı kültürden sonra 48 saat kadar erken bir sürede açığa çıkarmak, fizyolojik fakültelerini kaybetmelerini önler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-116-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD11b BV421</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1106255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CD45 BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1115690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>1345075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse NeuN PE</td>
			<td>Milli-Mark</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti mouse O4 Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-120-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc blocking reagent (Mouse CD16/32)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon ECLIPSE TE300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14065049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14185045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR&#160;Green Supermix</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1725006CUST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscript c-DNA synthesis</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2776-1mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS) from&#160;Escherichia coli&#160;O55:B5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage-SFM serum-free medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12065074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (70 &#956;m), 4 x 25 pcs</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-110-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 PE</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC002H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG2a PE Cy7</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2601265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL1 beta</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-101-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-24 Column Blocks</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-095-691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiMACS Cell24 Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit - Papain</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleocounter NC-200</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleospin RNA Plus XS</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>740990.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>362694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P&#233;nicilline-streptomycine (10 000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2b, k BV510</td>
			<td>Sony Biotechnology</td>
			<td>2603230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) PE vio 615</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-104-616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control (S) Vio Bright B515</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IFN-gamma Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>485-MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-10 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>417-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>404-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability probe (FVS780)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565388</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures

Mikroglia, beyinde yerleşik makrofajlar olarak, çevresel strese ve beyin homeostazına yanıt da dahil olmak üzere çeşitli işlevlerin temelidir. Mikroglia, geniş bir aktivasyon fenotipi spektrumunu benimseyebilir. Ayrıca, pro-inflamatuar fenotipi destekleyen mikroglia hem nörogelişimsel hem de nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilidir. İn vitro çalışmalar, spesifik hücre tiplerinde potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, primer mikroglial kültürleri kullanarak in vitro mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonu incelemek, mikroglial hücre hatlarından veya kök hücre kaynaklı mikroglialardan daha önemlidir. Bununla birlikte, bazı birincil kültürlerin kullanımı tekrarlanabilirlik eksikliğinden muzdarip olabilir. Bu protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntem önermektedir. Burada mRNA ekspresyon nicelemesi ve Cy3-boncuk fagositik testi ile 4 saat ve 24 saat sonra birkaç uyaran kullanılarak mikroglial aktivasyon gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın, fizyolojik olarak ilgili mikroglia'yı juvenil gelişim aşamalarından izole etmek için kolayca tekrarlanabilir bir teknik sağlaması beklenmektedir.

Microglia, çevresel zorluklara (travma, toksik moleküller, inflamasyon) maruz kaldığında aktive olan CNS yerleşik makrofajıdır (Şekil 3A). Mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar, bu çevresel zorluklarla ilgili hücre otonom mekanizmalarını değerlendirmek ve farmakolojik veya genetik manipülasyon sonrası aktivasyon durumunu karakt...

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures at JoVE.com

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Bu protokol, mikroglia'yı in vivo özellikleri yakından taklit eden koşullarda kültürlememizi sağlar. Manyetik hücre sıralama teknolojisini kullanarak, protokolümüz kültür ortamında herhangi bir serum kullanmadan mikroglia'yı sadece iki gün in vitro olarak uyarmamızı sağlar. Başlamak için, 15 ila 20 milimetrelik sagital sütürü takiben, cildi boyundan buruna kesmek için küçük makas kullanın.Uçları kafatasına paralel foramen magnum ile yerleştirin. Her iki taraftan gözlere kadar kesin. Kafatasını ve beyni kafadan ayırmak için gözler arasında küçük makasla kesin.İki forseps ile kafatasını koku alma ampullerine yakın tutun ve kafatasını dikkatlice yırtın. Bir tıraş bıçağı ile beyincik ve olfaktif ampulü çıkarın ve beyni iki parçaya bölün. Beyin parçalarını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 40 mililitre HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin.Bu tabloya göre ayrışma karışımını hazırlayın. 12 beyin parçasını, ayrışma tüpü başına toplam 1.2 gram ağırlık için bir C tüpüne aktarın. Daha sonra C tüplerini ısıtıcı ile ayrıştırıcıya yerleştirin.Optimize edilmiş NTDK programını dissosiyatörde başlatın. 20 saniye santrifüj. Üç kez pipetleme yaparak mekanik ayrışmayı tamamlayın.Hücreleri, bağlı süzgeçlerle dört adet 15 mililitrelik tüpe aktarın. Süzgeçleri kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ile durulayın. 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı 10 mililitrelik bir pipetle çıkarın.Kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ekleyin ve peleti tekrar askıya alın. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve çıkarın. Peleti altı mililitre ayıklama tamponu ile yeniden askıya alın.Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. Daha sonra 200 mikrolitre CD11b mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, peleti altı mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın.Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve peleti sekiz mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın. Ardından, sekiz sütun hazırlamak için ayırıcıdaki Possel programını izleyin. Bir seferde bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri sütundan geçirin.Bir mililitre ayıklama tamponu ile, CD11b-pozitif hücreleri steril bir elüsyon plakası üzerinde süzün. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Peleti 10 mililitre soğuk mikroglia ortamı ile santrifüj yapın ve tekrar askıya alın.CD11b-pozitif hücreleri sayın. Mililitre başına 650.000 ila 700.000 hücrelik bir son konsantrasyon elde etmek için hücreleri soğuk mikroglia ortamında tekrar askıya alın. Süspansiyonu hücre kültürü plakalarına dağıtın.Plakaları gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı önceden ısıtılmış mikroglia ortamı ile değiştirin ve gece boyunca inkübasyonu tekrarlayın. Bu adımdan önce hücreleri uyarın ve stimülasyonun son üç saati boyunca fagositik tahlil yapın.Bu tabloya göre boncuk sayısını hücre başına 50 boncuk oranında hesaplayın. Boncuk karışımını hazırlayın. Tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin.Her 10 dakikada bir vorteks. Her bir kuyucuğa, boncuk çözeltisinin hesaplanan hacmini ekleyin ve üç saat boyunca inkübe edin. Bu yaklaşımı kullanarak, mikroglia'nın fagositik aktivitesi, interlökin-1 beta, artı interferon gama veya lipopolisakkaritler gibi pro-inflamatuar faktörler tarafından stimülasyondan sonra değerlendirildi.Altı ila 24 saat boyunca stimülasyondan sonra, floresan Cy3 mikroglia boncukları konfokal mikroskopla analiz edildi. Altı saat sonra, mikroglia sadece interlökin-1 beta artı interferon gama durumu altında Cy3 boncuklarını fagosit etmeye başlar. 24 saat sonra, her iki stimülasyon türü için de Cy3 floresansında bir artış oldu ve bu da fagositik aktivitenin arttığını vurguladı.Mikroglial kültürün saflığı, sıralamadan sonra hücre canlılığında bir artış gösteren akış sitometrisi ile yükseltildi. Akış sitometrisi ve RT-qPCR hücre popülasyonu belirteçleri kullanılarak, doğum sonrası sekizinci günde farelerin beyinlerinden CD11b-pozitif hücrelerin ayrılmasından önce ve sonra analiz edildi. Bu analizler, mikroglia için CX3CR135, O4 veya oligodendrositler için OLIG2, nöronlar için NeuN veya sinaptofizin ve astrositler için ACSA-2 veya GFAP gibi çeşitli beyin hücresi popülasyonlarını ayırt etti.CD11b antikoru kullanılarak hücre sıralama yapıldıktan sonra sadece mikroglia elde edildi. Tıkanmayı önlemek ve mekanik hücre ölümünü önlemek için süspansiyonu kolona eklerken çok nazikçe pipet uygulamak önemlidir. Bu yöntemden sonra, mikroglial stimülasyonun etkisini görmek için batı kanı veya Luminex gibi transkriptomik proteomikler ve hatta immünokimya yapılabilir.

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

Abstract