Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono il tipo più grave di danno al DNA. Nonostante le conseguenze catastrofiche sull'integrità del genoma, rimane finora elusivo il modo in cui i DSB influenzano la trascrizione. Una ragione di ciò era la mancanza di strumenti adeguati per monitorare contemporaneamente la trascrizione e l'induzione di un DSB genico con sufficiente risoluzione temporale e spaziale. Questo lavoro descrive una serie di nuovi reporter che visualizzano direttamente la trascrizione in cellule vive immediatamente dopo l'induzione di un DSB nel modello di DNA. Gli stem-loop dell'RNA batteriofago sono impiegati per monitorare la trascrizione con sensibilità a singola molecola. Per indirizzare il DSB a una specifica regione genica, i geni reporter sono progettati per contenere una singola sequenza di riconoscimento dell'endonucleasi di homing I-SceI, altrimenti assente dal genoma umano. Una singola copia di ogni gene reporter è stata integrata nel genoma delle linee cellulari umane. Questo sistema sperimentale permette la rilevazione di singole molecole di RNA generate dalla trascrizione genica canonica o dall'inizio della trascrizione indotta da rottura del DNA. Questi reporter offrono un'opportunità senza precedenti per interpretare le interazioni reciproche tra trascrizione e danno al DNA e per rivelare aspetti finora non apprezzati della trascrizione indotta dalla rottura del DNA.