Imagerie en direct de l’état redox du glutathion mitochondrial dans les neurones primaires à l’aide d’un indicateur ratiométrique

L’homéostasie redox mitochondriale est importante pour la viabilité et la fonction neuronales. Bien que les mitochondries contiennent plusieurs systèmes redox, le glutathion tampon redox thiol-disulfure très abondant est considéré comme un acteur central dans les défenses antioxydantes. Par conséquent, la mesure du potentiel redox du glutathion mitochondrial fournit des informations utiles sur le statut redox mitochondrial et le stress oxydatif. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) est un indicateur ratiométrique à base de protéine fluorescente verte (GFP) génétiquement codé du potentiel redox du glutathion qui a deux pics d’excitation sensibles à l’état redox à 400 nm et 490 nm avec un seul pic d’émission à 510 nm. Cet article explique comment effectuer une microscopie confocale vivante de Grx1-roGFP2 ciblant les mitochondries dans les neurones primaires de l’hippocampe et du cortical. Il décrit comment évaluer le potentiel redox du glutathion mitochondrial à l’état d’équilibre (par exemple, pour comparer les états pathologiques ou les traitements à long terme) et comment mesurer les changements redox lors des traitements aigus (en utilisant le médicament excitotoxique N-méthyl-D-aspartate (NMDA) à titre d’exemple). En outre, l’article présente la co-imagerie de Grx1-roGFP2 et de l’indicateur de potentiel de la membrane mitochondriale, la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE), pour démontrer comment Grx1-roGPF2 peut être multiplexé avec des indicateurs supplémentaires pour les analyses multiparamétriques. Ce protocole fournit une description détaillée de la façon de (i) optimiser les réglages du microscope confocal à balayage laser, (ii) appliquer des médicaments pour la stimulation suivis d’un étalonnage du capteur avec du diamide et du dithiothréitol, et (iii) analyser les données avec ImageJ / FIJI.