이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF) 프로젝트 P30214-N36, P32307-B, 비엔나 과학 기술 기금 (WWTF) LS13-030에 의해 지원되었다.

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 문서에서는 모바일 아직 표면 테더링된 프로브 분자에서 비롯된 smFRET 데이터의 자동화된 기록 및 정량적 분석을 위한 파이프라인을 자세히 설명합니다. 그것은 smFRET 실험에 대한 두 가지 주요 접근 방식을 보완, 공초점 여기 볼륨17안팎에서 솔루션으로 확산 표면 고정 프로브 또는 프로브 중 하나를 포함17. 그것은 시간의 함수로서 올바른 FRET 효율과 분자 위치를 제공합니다. 따라서 전이 운동학1, FRET 히스토그램39 또는 2차원 확산22를 정량화하기 위해 특수 분석 프로그램에 대한 입력으로 사용할 수 있습니다.
이 소프트웨어는 사용자에게 무료 사용, 수정 및 재배포할 수 있는 영구적인 권리를 부여하는 오픈 소스 이니셔티브에 의해 승인된 무료 및 오픈 소스 라이선스에 따라 릴리스됩니다. Github는 버그를 보고하거나 code40을 기여하여 소프트웨어를 최대한 쉽게 확보하고 개발 프로세스에 참여할 수 있도록 개발 및 배포 플랫폼으로 선정되었습니다. 파이썬으로 작성된 이 소프트웨어는 독점 구성 요소에 의존하지 않습니다. 사용자 인터페이스로 Jupyter 노트북을 선택하면 모든 분석 단계에서 데이터 검사를 용이하게 하고 현재 실험 시스템을 위해 파이프라인을 조정하고 확장할 수 있습니다. sdt-python library32 는 단일 분자 국소화, 확산 분석, 형광 강도 분석, 컬러 채널 등록, 공동 지역화 분석 및 ROI 처리와 같은 형광 현미경 데이터를 평가하는 기능을 구현합니다.
원칙적으로 단일 입자 추적은 1차원, 2차원 또는 3차원 시스템에서 수행될 수 있습니다. 여기서, 단일 분자 분석 파이프라인은 2D 모바일 시스템의 연구에 맞추어졌습니다. 이 선택은 플랑어 지원 지질 이중층(SLB)과 같은 간단한 시스템의 가용성을 반영하여 모바일 형광 프로브를 제공합니다. 이러한 지질 이중층 시스템은 전형적으로 2개 이상의 인지질계로 구성되며, 벌크 분획은 SLB의 주요 물리화학적 파라미터(예: 위상 및 점도)를 결정하고, 사소한 분획은 생체분자에 대한 부착 부위를 제공한다. 이러한 부착 부위는 히스티딘 태그41을 가진 단백질 플랫폼을 위한 아비딘 또는 스트렙타비딘 기반 단백질 플랫폼 또는 니켈-NTA 컨쥬게이드 인지질에 대한 생체자극성 인지질일 수 있다. SLB에 단백질을 연결하기 위한 적절한 플랫폼의 선택은 과학적 질문에 달려 있습니다. 독자는 성공적으로 채택 된 전략의 예를 들어 문학16,38,42를 참조 할 수 있습니다. 샘플의 프로브 밀도는 겹치는 점 확산 함수를 피하기에 충분히 낮아야 합니다. 전형적으로, μm2당 0.1 미만의 분자가 권장됩니다. 적합한 프로브 밀도를 나타내는 예는 대표적인 결과 섹션(특히 도 6)을 참조하십시오. 분석 방법은 또한 살아있는 세포의 혈장 막에서 확산되는 단일 형광 표지 단백질 분자에 적용됩니다.
smFRET 실험의 한 가지 중요한 측면은 FRET 프로브 자체의 생산 및 특성입니다. FRET 쌍에 대한 형광을 선택할 때, 그들의 Förster 반경은 예상된 염료 간 거리43과 일치해야 합니다. 장시간 흔적을 얻을 수 있기 때문에 포토표백에 강한 염료가 선호됩니다. 그러나, 높은 표백 비율에 대 한, 1 개의 형광종 단계별 광 표백 분석을 통해 지역화 된 분자에서 유래 하는 다중 혈소판 이벤트를 인식 하기 위해 활용할 수 있습니다.; 프로토콜 섹션에서 8.1.4 단계를 참조하십시오. 불소엽소 쌍은 사이트 특이적으로 그리고 관심있는 분자에 공유하게 되어야 하며, 분자 간 FRET 쌍을 형성해야 한다.
smFRET와 쉽게 사용할 수 있는 다른 기술을 결합하면 회절 제한을 초과하여 공간 해상도를 높일 수 있습니다(STED44 를 통해). 여기에 제시된 smFRET 추적 알고리즘은 새로운 실험 설정 및 모델 시스템에 대한 접근 방식의 적용 가능성을 넓혀주입니다. 여기에는 이동식 생체 분자의 스토이치오메트리(stoichiometry) 역학 적 변화, (ii) 모바일 생체 분자의 동적 연관성, (iii) 자유롭게 확산 반응의 효소 반응 의 속도, 그리고 (iv) 모바일 생체 분자의 형성 변화의 운동의 운동학의 연구가 포함된다. 처음 두 가지 예는 분자 간 FRET, 즉 기증자 및 수용자가 관심있는 생체 분자 개체를 분리하기 위해 공주되는 것을 보여주는 모델 시스템을 요구합니다. 후자의 예는 동일한 분자 실체(분자 내 FRET) 내에서 기증자 및 수용자를 운반하는 바이오 센서를 사용할 수 있습니다.
분자 내 FRET 기반 센서는 생체 분자의 본질적인 형성 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다1,2,3,4, 내인성 또는 외부 힘 부하로 인한 형성 변화 (분자 력 센서16), 또는 칼슘45 및 pH46와 같은 나노 환경에서 이온 농도 . 모델 시스템 및 바람직한 앵커링 플랫폼에 따라, 이러한 smFRET 이벤트는 2D 또는 3D로 추적될 수 있습니다: (i) smFRET 이벤트의 평면 추적은 플라즈마 멤브레인 내의 수용체-리간드 상호작용 시간의 정량화, 멤브레인 고정 신호 증폭 캐스케이드의 연관성 및 표면 수용체의 스토이치오메이트리 변화에 사용될 수 있다. (ii) smFRET 이벤트의 부피 추적은 살아있는 세포 또는 체외 재구성 시스템에서 임의의 분자 간 FRET 프로브에 사용될 수 있다.
smFRET 추적 방법은 주로 분자 내 FRET 프로브를 염두에 두고 개발되었다. 이 프로브는 응집되고 잘못 합성된 분자(예: 불완전하게 표지된) 분자로부터 데이터를 거부하는 데 악용된 사실뿐만 아니라 형광술 중 하나가 포토블리치된 프로브에서 수집되고 잘 알려진 형광 라벨수를 특징으로 합니다. 그러나 필터링 단계를 조정함으로써 분자 간 FRET 프로브에도 방법을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 기증자와 단일 수용자 형광소를 특징으로 하는 분자만 받아들이는 대신, 기증자 및 수용자 염료의 공간 궤적을 검사하고 예를 들어, 공동 확산 기증자 수용자 궤적을 선택할 수 있습니다.
3D-DAOSTORM 알고리즘은 배출 빔 경로의 원통형 렌즈로 인한 난시를 통해 광학 축을 따라 신호의 위치를 결정하는 지원을 하므로 3D 실험은 분석 파이프라인에 쉽게 통합될 수 있습니다. 이 경우, 수락자 여기시 수락신호는 금식성 및 축 위치를 결정하는 역할을 한다. 또한 분석 소프트웨어는 대규모 자동화 및 필터링 체계를 활용하여 고정 프로브를 특징으로 하는 실험의 데이터를 평가하는 데도 사용할 수 있습니다. 실제로, 젤상 바이레이어38 에 고정된 홀리데이 접합부에서 smFRET 효율 데이터 세트를 초기 버전의 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다.

Förster 공명 에너지 전송 (FRET)은 나노미터 이하 해상도에서 프로세스의 조사를 허용하기 때문에 분자 생물학 및 생물 물리학 연구의 주요 원동력이었습니다. 기증자와 수용자 형광사이의 에너지 전달효율이 나노미터 범위이하나노미터의 염료 간 거리에 크게 의존하기 때문에 생체분자의 정적 및 동적 형태형성을 탐구하는 분광도피로서 효과적으로 사용되고 있다1,2,3,4. 추가적으로, FRET 현상은 대량 수준에 막 관련및 세포내 단백질의 colocalization 연구 결과에 널리 이용되었습니다5,6. 지난 2년 동안 이 방법은 smFRET 이벤트를 모니터링하기 위해 조정되었으며, 이는 시간적 및 공간 적 해상도를 실질적으로 증가시키고 이질적인 샘플에서 드문 하위 집단도 해결하는 데 도움이 되었습니다. 이러한 기술을 탑재한 독특한 통찰력은 RNA 폴리머라제 II8의 전사체 처리 속도, DNA 폴리머라제9,10의 복제 속도, 뉴클레오성 전좌 속도111, 조립된 스플리케솜12의 전사체 접합 및 실속속도, 리보소말 하수집단13의 활성, 리보소말 하수집단의 활동 13, 걷기 속도 등 분자 기계의 역학에 대한 독특한 통찰력을 얻었다. , 몇 가지 이름을 지정합니다. 수용체-리간드 상호작용 지속시간15 및 분자력16이 정량화되었다.
강도 기반 smFRET 연구는 일반적으로 FRET 효율을 측정하기 위해 감격 방출에 의존합니다: 방출 경로의 빔 스플리터는 기증자 의 발동시 및 수용자 형광에서 유래한 빛을 공간적으로 분리하여 개별 형광 강도의 정량화를 허용합니다. 효율성은 이어서 총 광자 count17에 대하여 수용자가 방출하는 광자의 분수로 계산될 수 있다. 또한, 기증자 여기(ALEX)에 따른 수락자는 FRET 이벤트의 스토이치오메트리측정을 허용하여, 사진 표백된 수용자 형광호re18을 특징으로 하는 프로브로부터 발생하는 신호로부터의 실제 낮은 FRET 신호 사이의 차별을 돕는다.
단일 분자 FRET 실험은 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에서 수행됩니다. 첫째, 시료 부피의 작은 영역은 공초점 현미경을 사용하여 조명된다. 용액의 단일 프로브 분자는 초점 부피 내에서 확산될 때 흥분됩니다. 이 기술을 사용하면 빠른 광자 계수 검출기를 사용하여 초초 시간 해상도를 구현할 수 있습니다. 둘째, 프로브는 특히 표면에 고정되어 와이드필드 현미경 검사를 통해 모니터링되며, 종종 전체 내부 반사(TIR) 구성을 사용하여 배경 형광을 최소화합니다. 프로브 고정을 사용하면 첫 번째 접근 방식을 사용하는 것보다 훨씬 긴 기록 시간을 허용합니다. 또한 시야가 클수록 여러 프로브를 병렬로 모니터링할 수 있습니다. 카메라의 필요성으로 인해 이 방법은 위에서 설명한 방법에 비해 느리게 만듭니다. 시간 해결은 밀리초에서 두 번째 범위로 제한됩니다.
장시간 추적이 필요한 경우, 예를 들어, 밀리초에서 두 번째 시간 척도로 동적 프로세스를 연구하기 위해 형광 버스트가 일반적으로 너무 짧기 때문에 첫 번째 방법은 적용되지 않습니다. 두 번째 접근법은 침전이 실현 가능하지 않을 때마다 실패합니다(예: 세포막 내의 확산 프로브를 특징으로 하는 살아있는 세포 실험). 더욱이, 생물학적 모델 시스템은 접촉된 surface16의 이동성에 따라 그들의 반응을 극적으로 변화시킬 수 있다는 것을 관찰되었다.
모바일 FRET 프로브를 기록하는 결합 된 smFRET 및 단일 입자 추적 실험은 지난 19에서 수행되었지만 데이터 평가를 위한 공개적으로 사용할 수있는 소프트웨어는 없습니다. 이로 인해 smFRET 효율 및 스토이치오메트리, 서브 픽셀 정확도를 가진 위치 및 시간 함수로서의 형광 강도를 포함하여 모바일 형광 프로브의 여러 특성을 판단할 수 있는 새로운 분석 플랫폼이 개발되었습니다. 단계별 표백 거동, 가장 가까운 이웃 거리, 방출 강도 및 기타 특성을 검사하여 결과 추적을 필터링하는 방법은 올바르게 합성되고 기능적인 단일 프로브 분자를 독점적으로 선택하도록 설립되었습니다. 이 소프트웨어는 또한 신뢰할 수있는 정량적 smFRET 데이터를 생산하기 위해 다연구소 연구에서 최근에 합의 된 실험 및 분석 기술을 지원합니다17. 특히 구현은 FRET 효율 및 스토이치오메트리 계산을 위한 검증된 절차를 준수합니다. 기증자 배출 채널 IDD 및 수용자 방출 채널 IDA에서 기증자 의 발 아 시 형광 강도는 Eq (1)를 사용하여 명백한 FRET 효율 Eapp의 계산에 사용됩니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq01.jpg"> (1)
수용자 내영 IAA시 수용체 방출 채널에서 형광 강도의 도움으로, 명백한 스토이치 오메트리는 Eq(2)를 사용하여 계산된다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq02.jpg"> (2)
FRET 효율 E와 스토이치오메트리 S는 4가지 보정 요소를 고려하여 Eapp 및 Sapp에서 파생될 수 있습니다.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq03.jpg">
α 기증자 형광이 수용체 방출 채널로 유출되는 것을 설명하고 기증자 형광만 을 포함하는 샘플을 사용하거나 수용자가 표백된 궤적의 일부를 분석하여 결정할 수 있습니다. δ 기증자 흥분 광원에 의해 수용자의 직접 흥분을 보정하고 단지 수용자 형광이있는 샘플을 사용하여 또는 기증자가 표백 된 궤적의 일부를 분석하여 측정 할 수 있습니다.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq04.jpg">.
γ 기증자 및 수용자 방출 채널및 형광의 다른 양자 효율성에서 발산 검출 효율성을 바로잡기 위해 IDD를 확장합니다. 이 요인은 높은 FRET 효율20을 가진 궤적에서 수용자 표백 시 기증자 강도의 증가를 분석하거나 다중 이산 FRET 상태를 특징으로 하는 샘플을 연구함으로써 계산될 수 있다.
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq05.jpg">
β IAA를 조정하여 기증자와 수락자 엑소터의 이질적인 효율성을 수정합니다. γ 수용자 표백 분석을 통해 결정된 경우, 알려진 기증자 대 수용자 비율21의 샘플에서 β 계산될 수 있었다. 그렇지 않으면 다중 상태 FRET 샘플도 β 산출합니다.
함께 수정하면 Eq(3)를 사용하여 수정된 FRET 효율을 계산할 수 있습니다.
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq06.jpg"> (3)
및 Eq (4)를 사용하여 교정 된 금전 측정.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63124/63124eq07.jpg"> (4)
이상적으로, 1:1 기증자-수용자 비율에 대한 교정된 스토이치오메트리는 S = 0.5를 준다. 실제로 신호 대 잡음 비율이 감소하면 S의 측정값이 확산되어 기증자 전용 신호(S =1) 및 수용자 전용 신호(S = 0)의 차별을 방해합니다. 결과 시간 추적은 단일 분자 궤적 프로파일16, 단일 분자 events22의 이동성 또는 상이한 상태 간의 전이 운동과 같은 정보를 얻기 위해 단일 분자 궤적의 보다 상세한 분석을 위한 입력으로 사용될 수 있다1.
다음 프로토콜은 smFRET 추적 실험에 대한 실험 매개 변수 및 절차뿐만 아니라 새로 개발 된 소프트웨어 제품군을 사용하여 데이터 분석 뒤에 작동하는 원리를 설명합니다. 실험 데이터의 수집을 위해, 다음 요구 사항을 충족하는 현미경 설정을 사용하는 것이 좋습니다: i) 단일 염료 분자의 방출을 검출하는 기능; ii) 와이드 필드 조명 : 특히 라이브 셀 실험에 대한, 총 내부 반사 (TIR23,24,25) 구성이 권장됩니다; iii) 동일한 카메라 chip25 또는 상이한 카메라의 상이한 영역에 공여자 및 수용체 형광이 투사되는 파장에 따른 방출광의 공간 분리; iv) 공여자 및 수용자 여기를 밀리초 정밀도로 광원의 변조, 예를 들어, 직접 변조 레이저 또는 아쿠스토 광학 변조기를 통해 변조를 사용한다. 이것은 형광의 광표백을 최소화하고 궤양궤수를 결정하기 위해 회신을 번갈아 가며 스트로보스코픽 조명을 허용합니다. v) PIMS Python package26에서 읽을 수 있는 형식으로 기록된 이미지 시퀀스당 하나의 파일의 출력. 특히 다중 페이지 TIFF 파일이 지원됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) (Ni-NTA-DOGS)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>790404P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945; Plan-FLUAR 100x/1.45 oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1084-514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer microscope body</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET570/60m</td>
			<td>donor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>Chroma Technology Corp</td>
			<td>ET675/50m</td>
			<td>acceptor emission filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conda-forge</td>
			<td>conda-forge community</td>
			<td></td>
			<td>community-maintaned Python package repository for Anaconda/miniconda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 60 mm x 24 mm #1.5</td>
			<td>MENZEL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>FF640-FDi01-25&#215;36</td>
			<td>separation of donor and acceptor emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (quad band)</td>
			<td>Semrock Inc</td>
			<td>Di01-R405/488/532/635-25&#215;36</td>
			<td>separation of excitation and emission light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fret-analysis</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python package for smFRET data analysis; version 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11524766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBeam Smart 405-S 405 nm laser</td>
			<td>Toptica Photonics AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab-Tek chambers (8 wells)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177402PK</td>
			<td>for sample preparation and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millenia Prime 532 nm laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miniconda</td>
			<td>Anaconda Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Python 3 distribution. Min. version: 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monovalent streptavidin (plasmids for bacterial expression)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>20860 &#38; 20859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OBIS 640 nm laser</td>
			<td>Coherent Inc</td>
			<td>1185055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optosplit II</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5253</td>
			<td>for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sdt-python</td>
			<td>Sch&#252;tz group at TU Wien</td>
			<td></td>
			<td>Python library for data analysis; version 17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpek bead size kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T14792</td>
			<td>Randomly distributed, immobilized fiducial markers for image registration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USC500TH Ultrasound bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>for SUV formation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated two-dimensional spatiotemporal analysis of mobile single-molecule fret probes

단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET)은 나노 미터 범위에서 나노 미터 범위까지의 거리에 보고되는 다목적 기술입니다. 그것은 분자 력의 측정, 생체 분자의 형성 역학의 특성화, 단백질의 세포 내 지역화의 관찰 및 수용체 리간드 상호 작용 시간의 측정을 포함하여 광범위한 생물 물리학 및 분자 생물학적 실험에 사용되었습니다. 와이드필드 현미경 검사법 구성에서는 일반적으로 표면 고정 프로브를 사용하여 실험이 수행됩니다. 여기서, 단일 분자 추적과 교대 로 의외(ALEX) smFRET 실험을 결합하여 표면 바운드의 smFRET 시간 추적의 획득을 허용하면서도 플라즈마 멤브레인 또는 유리지원 지질 이중층의 이동 프로브가 제시된다. 기록된 데이터의 분석을 위해, 자동화된 오픈 소스 소프트웨어 수집은 (i) 형광 신호의 국소화, (ii) 단일 입자 추적, (iii) 교정 인자를 포함한 FRET 관련 수량의 결정, (iv) smFRET 추적의 엄격한 검증 및 (v) 결과의 직관적인 프리젠테이션을 지원하여 개발되었다. 생성된 데이터는 프로브의 확산 거동 평가 또는 FRET 전환의 조사를 위해 특수 소프트웨어를 통한 추가 탐색을 위한 입력으로 편리하게 사용할 수 있습니다.

실험의 과학적 질문에 따라 smFRET 트랙에서 다양한 저급 및 높은 수준의 정보를 추출할 수 있다. 여기서, 아날로그 및 디지털 프로브를 가진 분석 파이프라인의 예가 제시됩니다: 펩티드 계 분자력 센서16 및 그 형성의 스토세스 스위칭을 가진 DNA 프로브38, 각각. 이러한 프로브의 설계 및 작동 원리에 대한 그림 5 를 참조하십시오.
프로토콜에 설명된 대로 지역화 및 추적 알고리즘이 실행된 후 패키지는 초기 매개 변수 및 후속 필터 단계를 최적화하기 위한 여러 데이터 시각화 도구를 제공합니다: (i) 개별 smFRET 이벤트의 시각화, (ii) 선택적 이미지 세분화는 관심 있는 특정 영역에서데이터를 분석하고, (iii) FRET 효율 대 스토이치오메이트리(E-S) 플롯을 통한 필터 단계 모니터링. 단일 분자 데이터의 시각화는 도 6에 제시된다.
마지막으로 필터링된 FRET 이벤트는 E-S 플롯과 FRET 효율 히스토그램(그림 4)으로 표시됩니다. E-S 플롯은 앞서 언급한 필터링 단계를 최적화하고 최종 결과를 조사하는 데 유용한 도구입니다. 부분적으로 표백되거나 불완전하게 표지된 FRET 센서는 스토이치오메트리 값으로 제외될 수 있습니다. 이동성 매개 변수는 x-y 플롯(그림 6) 또는 평균 정사각형 변위(MSD) 플롯(그림 4)에서 개별 궤적 경로를 플로팅하여 조사할 수 있습니다. 첫 번째 방법은 고정 된 이벤트에서 모바일을 차별하는 데 특히 유용하며 후자는 확산 계수를 계산하는 데 사용됩니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig04.jpg"> 그림 4: 예시출력. (A) FRET 효율은 유리지지 지질 이중층을 장식하고 T 세포에 의해 긴장되는 분자력 센서(좌패널)의 집단을 위해 스토이치오메트리(E-S 플롯)에 비해 플롯된다. 하나의 인구 클라우드만 표시됩니다. FRET의 각각의 히스토그램은 세포(중간 패널)의 존재와 부재에서 힘 센서 집단 간의 차이를 예시한다. T 셀이 있는 센서 집단의 FRET 효율을 낮추기 위한 이동은 관찰될 수 없으며, 이는 센서 모듈의 힘 의존적 스트레칭을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 실험 조건의 MSD 플롯은 T 셀 아래의 힘 센서 인구가 언바운드 대응(오른쪽 패널)보다 상당히 느리게 움직이는것을 확인합니다. (B) 동일한 분석은 유리 지원 유체 지질 이중층을 장식하는 홀리데이 접합 DNA 센서로 수행되었다. E-S 플롯은 FRET 효율 히스토그램에서도 명백한 두 개의 인구를 명확하게 보여줍니다. MSD 플롯은 빠르게 움직이는 하나의 센서 채우기의 존재를 나타냅니다. 약어: FRET = Förster 공명 에너지 전송; MSD = 평균 정사각형 변위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig05.jpg"> 그림 5: 분자 내 FRET 프로브의 설계 및 작동 원리. (A) 기계 분자력의 정량화를 위한 아날로그 펩타이드 센서. 기증자 및 수용자 형광은 펩티드 백본의 양쪽 끝에 공동으로 부착됩니다. 센서 모듈은 특정 리간드에 부지에 특별히 부착되어 있으며, 이는 차례로 관심있는 세포 거주자 표면 수용체를 결합합니다 (여기서, T 세포 수용체의 베타 사슬을 구체적으로 인식하는 항체 단편). 수용체 리간드 결합시 힘이 가해지고 센서 모듈이 결합 분열 후 결국 반동됩니다. 이 패널은 16에서 수정됩니다. (B) FRET 전이의 정량화를 위한 디지털 DNA 센서. FRET 센서는 홀리데이 접합을 형성하는 4개의 DNA 가닥으로 구성됩니다. 기증자와 수용자 불소는 두 가닥에 공유하게 부착됩니다. 홀리데이 접합부는 주변 버퍼 조건에 따라 변형을 자주 전환합니다. 이러한 적합성의 스토세스틱 스위칭은 개별 프로브의 FRET 효율을 정량화하여 모니터링할 수 있습니다. 약어: TCR = T 세포 수용체; FRET = Förster 공명 에너지 전송. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63124/63124fig06.jpg"> 그림 6: FRET 프로브의 현지화 및 추적의 예입니다. (A) 개별 이벤트의 FRET 효율 및 stoichiometry는 기증자 여기 (D → D), 기증자 여기시 수용자 불소 (D → A), 및 수락자 훈증 (a → A)에 따라 기증자 플루오로포어의 강도를 정량화하여 계산됩니다. 가장 가까운 이웃 필터링은 가까운 이미터의 포인트 확산 함수를 겹쳐바이어스를 방지합니다. 이미지 세분화를 통해 사용자는 관심 영역(예: 셀 또는 마이크로패턴)내에서 지역화된 특정 smFRET 이벤트를 선택할 수 있습니다. 이미지 세분화의 예로, T 셀은 Fura-2(왼쪽에 표시)로 염색되었고 셀 가장자리(주황색 점선)를 식별하기 위한 적응 형 임계값을 적용하였다. 스케일 바 = 분자력 센서를 이용한 5 μm. (B) 스마프레트 궤적. 개별 궤적을 x-y 평면에 플롯하여 확산 동작 및 지역화(왼쪽 패널)를 시각화할 수 있습니다. 또한, 각 궤적의 강도는 FRET 전환 또는 표백 단계를 식별하기 위해 시간이 지남에 따라 플롯 될 수있다 (중간 패널은 왼쪽 패널에서 빨간색 궤적을 보여줍니다). 결과 FRET 효율과 스토이치오메트리는 유사하게 시각화할 수 있습니다(오른쪽 패널). (C) 홀리데이 접합 DNA 센서를 이용한 smFRET 궤적. HBSS + 12 mM MgCl2 는 측정 중에 완충제로 사용되었다. 이러한 예의 서열 끝 부근의 명백한 수용체 표백 단계 외에도 각 센서에 대한 FRET 전이 주파수를 결정할 수 있습니다. 홀리데이 접합부는 고주파로 변형을 전환하지만 분자 력 센서는 FRET 전이를 나타내지 않습니다. 이 정보를 사용하면 프레임 간의 지연과 같은 실험 조건을 조정하여 관찰된 전환 수를 늘리거나 줄일 수 있습니다. 약어: FRET = Förster 공명 에너지 전송; smFRET = 단일 분자 FRET; HBSS = 행크의 균형 잡힌 소금 솔루션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/63124fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 정보: 단일 분자의 현지화 및 추적(01. Tracking.ipynb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63124/si.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

표면 결합 프로브를 사용하는 단일 분자 FRET 실험은 과거에 고정 된 분자에 거의 독점적으로 수행되었습니다. 그러나, 많은 생체 분자 확산 하 고 우리의 방법으로 분석될 수 있다. 단일 분자 FRET와 추적을 결합하면 움직이는 프로브의 FRET 결핍 시간 추적뿐만 아니라 확산 행동과 같은 현면 측면을 조사할 수 있습니다.우리의 방법은 다양한 FRET 기반 프로브와 호환됩니다. 예를 들면, 그것은 살아있는 세포 실험에 있는 분자 힘, 형성 역학 및 결합 역학에 관하여 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 고품질 단일 분자 FRET 실험은 수행하기가 매우 어렵습니다.신뢰할 수 있는 정량화를 위해 충분한 길이의 좋은 신호 대 잡음 비율 및 단일 분자 트랙으로 데이터를 기록하는 것이 중요합니다. 샘플 측정을 시작하려면 카메라를 트리거하는 동안 기증자와 수락자 형광을 적절한 조명 시간에 흥분시키고 카메라 판독이 활성화 될 때까지 기다립니다. 기증자와 수락자 형광의 흥분을 반복합니다.단계별 광표백 분석을 허용하는 시야 내에서 프로브 당 적어도 하나의 플루오로포어의 광표백을 보장하기에 충분한 큰 반복 횟수를 선택하여 골재로부터 단일 분자 신호를 차별한다. 기록된 이미지 시퀀스에서 이미지 세분화를 위한 프레임뿐만 아니라 기증자 및 수락자 여기 프레임을 선택할 수 있도록 조명 시퀀스를 지정합니다. 동시에 동일한 조명 설정을 사용하여 기록된 데이터 집합을 분석합니다.이를 위해 각 데이터 집합에 각각의 이미지 시퀀스 파일 이름과 일치하는 식별자 및 패턴을 할당합니다. 또한 이미지 등록을 위한 신탁 마커 녹음, 플랫 필드 보정을 위한 등계 광 프로파일, 선택적 기증자 전용 및 수락자 전용 샘플 과 같은 특수 목적을 위해 특정 데이터 집합을 정의하여 보정 요소를 결정합니다. 다음으로, 두 채널이 단일 카메라를 사용하여 기록되는 경우 배출 채널과 원시 이미지를 선택합니다.이를 위해 적절한 그래픽 위젯을 사용하여 기증자 및 수락자 배출에 적합한 영역을 선택한 다음 배출 채널 모두에서 수탁마커를 국소화하고 이미지 등록을 수행합니다. 제공된 사용자 인터페이스를 사용하여 기증자 및 수락자 배출 채널 모두에 대한 지역화 알고리즘에 적합한 매개 변수를 찾습니다. 다음으로, 기증자 및 수용자 방출로부터 얻은 이미지의 합계로 기증자 여기시 FRET 프로브에 대한 단일 분자 지역화 매개변수를 설정한 다음, 수용자 방출 채널에서 수용자 여기시 프로브에 대한 국소화 매개 변수를 설정합니다.모든 프레임에서 기부자 및 수락자 여기를 독립적으로 사용할 때 FRET 프로브를 현지화합니다. 결과는 원본 프레임 번호, 2차원 좌표 및 원본 이미지 파일을 참조하는 식별자를 포함하는 하나의 테이블로 병합됩니다. 형광 강도를 추적하고 측정하려면 Trackpy 알고리즘에 적합한 옵션을 선택하여 FRET 프로브 지역화를 궤적에 연결합니다.다음으로 분석 소프트웨어 기능을 사용하여 이미지 시퀀스에서 보조 이미지 데이터를 처리합니다. 여기 시퀀스에서 S로 표시된 세분화를 용이하게 하기 위해 기록된 추가 이미지를 추출합니다. 마지막으로, 조밀하게 표지된 샘플에 기록된 이미지에서 시야전반에 걸쳐 기증자 및 수락자 흥분 광 프로파일을 결정합니다.초기 필터링 단계의 경우 형광 강도를 안정적으로 결정하기 어렵기 때문에 겹치는 점 확산 기능을 사용하여 신호를 폐기하십시오. 불균성 조명의 경우, 좋은 신호 대 잡음 비율을 보장하기 위해 시야 내의 조명 이면에 있는 신호만 허용한다. 분자 내 FRET를 공부하는 경우, 이미지 시퀀스의 시작부분에서 존재하는 궤적으로 분석을 제한한다.다음으로, 앞서 획득한 광원 프로파일을 사용하여 불균성 조명으로 인한 위치 의존형 형광 강도 변동을 되돌리고 명백한 FRET 효율과 명백한 stoichiometry를 계산하는 평평한 필드 보정을 실행한다. 단일 분자 프로브와 골재 간의 차별에 대한 광표백의 단계별 분석을 수행하려면 기증자 및 수락자 여기에 따라 변경 점 검출 알고리즘에 적합한 매개 변수를 별도로 찾아보십시오. 그런 다음 변경 점 감지 알고리즘을 실행합니다.모호한 광표백 동작을 보여주는 트랙을 제거하려면 형광이 표백된 것으로 간주되는 강도 임계값을 정의한 다음 다음 옵션 중 하나를 선택합니다. 옵션 하나는 기증자가 부분 표백을 보여주지 않는 동안 한 단계로 수용자 형광표백을 하는 것을 여기서 선별한다. 옵션 2는 기증자가 부분 적인 수용체 표백이 없는 동안 한 단계로 표백하는 것을 허용합니다.옵션 3은 한 단계로 형광표백제중 하나를 표백하는 반면 다른 하나는 부분적으로 표백하지 않는다. 그리고 옵션 4 에 기증자 및 수용자 형광은 단단계 광표백 또는 전혀 표백을 표시하지 않습니다. 그런 다음 기부자 배출 누출에 대한 보정 요인을 수락 채널, 직접 수락자 여기, 검출 효율성 및 흥분 효율성으로 계산합니다.다음으로 보정 요소를 사용하여 명백한 효율성과 명백한 stoichiometry의 stoichiometry에서 FRET 효율을 계산합니다. 추가 필터링을 위해 각 궤도에서 첫 번째 표백 이벤트 이전의 데이터 점만 선택합니다. 또한 분석을 단일 분자 프로브로 제한하려면 적절한 스토이치오메트리 한계 내에서 데이터 포인트의 75% 이상을 가진 궤적만 허용합니다.그런 다음 적절한 보조 이미지에서 전역 또는 적응형 임계값 을 통해 이미지 세분화를 수행하여 분석을 시야 내의 다른 영역으로 제한합니다. 잘못된 스토이치오메트리의 신호가 올바르게 식별되고 제거되었는지 확인하기 위해 효율성 과 스토이치오메트리 플롯을 만듭니다. 그런 다음 FRET 효율성의 히스토그램을 플롯하여 FRET 효율성 분포에 대한 잘 확립된 개요를 제공하고 히스토그램을 그룹화하여 다양한 실험에서 결과를 편리하게 비교합니다.과학 파이썬 라이브러리를 활용하여 전자 필기장 내의 데이터를 추가로 평가하여 확산 분석과 같은 성능을 발휘할 수 있습니다. 단일 분자 FRET 이벤트의 시각화 및 추적은 여기에 표시됩니다. 필터링된 FRET 이벤트는 FRET 효율 히스토그램의 효율성 대 스토이치오메트리 플롯으로 표현됩니다.또한, 이동성 매개 변수는 XY 플롯 또는 평균 제곱 변위 플롯에서 개별 궤도 경로를 플로팅하여 조사할 수 있다. 플랫폼의 출력을 통해 모바일 프로브의 FRET 효율 시간 추적에서 전환을 더욱 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 생체 분자의 형성 적 변화를 평가한다.FRET 기반 힘 센서를 사용하여 분석 플랫폼을 사용하면 초기 T 세포 신호 시그널링 중에 면역 학적 시냅스 내에서 단일 분자 힘 이벤트를 정량화 할 수있었습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

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