ניטור החמצת מעיים במעי דרוזופילה למבוגרים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מתוקנן לניטור החמצת המעיים ב Drosophila melanogaster עם תפוקה אופטימלית. תחילה אנו משתמשים בפרוטוקול זה לניטור החמצת המעיים ב - Drosophila melanogaster ולאחר מכן מדגימים את השימוש בו במינים שאינם מודל Drosophila .

Abstract

מידגוט זבוב הפירות מורכב מאזורים מרובים, שכל אחד מהם מורכב מתאים המבצעים פונקציות פיזיולוגיות ייחודיות הנדרשות לתפקוד תקין של המעיים. אזור אחד כזה, אזור תא הנחושת (CCR), הוא מקומי לאמצע midgut והוא מורכב, בחלקו, של קבוצה של תאים המכונה תאי נחושת. תאי נחושת מעורבים בהפרשת חומצת קיבה, תהליך שנשמר אבולוציונית שתפקידם המדויק אינו מובן כהלכה. מאמר זה מתאר שיפורים בפרוטוקול הנוכחי המשמש לבדיקת החמצה של המעיים הבוגרים Drosophila melanogaster ומדגים כי ניתן להשתמש בו על מינים אחרים של זבובים. בפרט, מאמר זה מדגים כי החמצת המעיים תלויה במצב התזונתי של הזבוב ומציג פרוטוקול המבוסס על ממצא חדש זה. בסך הכל, פרוטוקול זה מדגים את התועלת הפוטנציאלית של לימוד תאי נחושת Drosophila לחשוף עקרונות כלליים שבבסיס המנגנונים של החמצת המעיים.

Introduction

במעי החרקים, תאי נחושת חולקים קווי דמיון תאיים ותפקודיים עם תאי קודקוד הקיבה המייצרים חומצה (הידועים גם בשם אוקסינטי) של הקיבה היונקת. קבוצת תאים זו משחררת חומצה לתוך לומן המעי. הפונקציה של הפרשת חומצה ואנטומיה נשמרת אבולוציונית. המרכיבים העיקריים של החומצה המשוחררת הם חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד. המנגנון הכימי של היווצרות חומצה בתאים תלוי באנהידרז פחמתי. אנזים זה מייצר יון ביקרבונט _מפחמן דו-חמצני ומים, אשר משחרר יון הידרוקסיל כי הוא משוחרר לאחר מכן לתוך הלומן באמצעות משאבת פרוטון בתמורה אשלגן. יוני כלוריד ואשלגן מועברים לתוך הלומן על ידי ערוצי מוליכות וכתוצאה מכך היווצרות של חומצה הידרוכלורית ואשלגן כלוריד, המרכיב העיקרי של מיץ ^{קיבה1,2,3,4}

Protocol

הערה: קו המעבדה הסטנדרטי Oregon R שימש כפקד WT. כל הזבובים גודלו על מדיום רגיל של קמח תירס-מולסה (המכיל מולסה, אגר, שמרים, קמח תירס, טגוזפט, חומצה פרופיונית ומים) בטמפרטורת החדר עם 12/12 שעות שעון ביולוגי בהיר/כהה.

1. הכנה לבדיקה

1. לאסוף זבובים נשיים (0-2 ימים, לא בתולה) תחת הרדמה _CO2 ולאפשר להם להתאושש על מזון קמח תירס סטנדרטי לפחות 3 ימים לפני הניסויים.
2. הרעיבו את הזבובים במשך ~ 24 שעות בטמפרטורת החדר (~ 23 °C (~ 23 °C )? בבקבוקונים המכילים רקמת ניגוב מעבדה ספוגה ~ 2 מ"ל של מים deionized.
3. הכן את מזון הזבובים עם כחול ברומופנול (BPB) כדלקמן:
   1. ממיסים את מזון הזבובים במיקרוגל ואז נ....

תוצאות

הרעבנו זבובים נקבות אורגון R במשך יותר מ 20 שעות ולאחר מכן האכלנו אותם מזון בתוספת BPB (2%) עבור ~ 12 שעות, כפי שתואר בעבר 7,8,9,10,10,11^. ברומופנול כחול (באנגלית: Bromophenol Blue) הוא צבע חישת pH. הוא משתנה מצהוב ב-pH 3.0 לכחול.......

Discussion

צעד קריטי בפרוטוקול זה הוא החיתוך הנכון של המעיים כדי לדמיין את CCR עבור פנוטיפ החמצה. החומצה המשתחררת מתאי הנחושת מוגבלת ל- CCR כאשר המעיים שלמים. עם זאת, במהלך ניתוח, דליפה הנגרמת על ידי קרע של המעי יכול להוביל דיפוזיה של חומצה מן CCR ולגרום המעי בטעות ציון שלילי עבור החמצה. בנוסף, הצבע הצהוב המ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich		B0126
cellSens software	Olympus		Image aqusition (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens)
D. simulans	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Riverside California1 (https://www.drosophilaspecies.com/)
D. erecta	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Dere cy1(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. pseudoobscura	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Eugene, Oregon(https://www.drosophilaspecies.com/)
D. mojavensis	Drosophila Species Stock Center at the University of California		Chocolate Mountains, California (https://www.drosophilaspecies.com/)
Forceps	Inox Biology		Catalog# 11252-20
Fuji	Fuji		Image processing (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html)
Glass slide	VWR		Catalog#16005-108
Kim wipes Tissue	Kimtech
Microscope and camera	Olympus SZ61 microscope equipped with an Olympus D-27 digital camera		Imaging
Oregon R	Bloomington Drosophila Stock		(https://bdsc.indiana.edu/ # 2376)
Petri dishes	Fisher Scientific		Catalog #FB0875713A
Phosphate-buffered Saline (PBS)	HyClone		Catalog # SH30258.01
Stereomicroscope	Olympus SZ51		Visual magnification