מימון עבודה זו ניתן על ידי הקרן הלאומית למדע:
שיפור מענק החינוך STEM לתואר ראשון (פרס #1712268)
רשתות תיאום מחקר לתואר ראשון בחינוך לביולוגיה לתואר ראשון (פרס # 1920270)
אנו מודים לקרסטן ת'יס, PhD, אוניברסיטת ווסטפילד, על דיונים מועילים על Jmol.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים רלוונטיים או חומריים הקשורים למחקר המתואר במאמר זה.

פרוטוקול זה מתאר תהליך בן עשרה שלבים למידול של אתר פעיל אנזים, החל על ארבע תוכניות פופולריות למידול ביומולקולרי. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם: זיהוי הליגנדים באתר הפעיל, בחירת שאריות בתוך 5 Å להגדרת אתר פעיל, והצגת האינטראקציות של האנזים עם ליגנדים האתר הפעיל. הבחנה בין הליבנדים הרלוונטיים לתפקוד הביולוגי היא בעלת חשיבות עליונה, שכן זה מאפשר למשתמש להגדיר את שאריות חומצת האמינו בתוך 5 Å שיכול לשחק תפקיד בכריכת ליגנדים. לבסוף, שימוש בתוכנית להצגת אינטראקציות מולקולריות מאפשר למשתמש לפתח את הכישורים הדרושים כדי להבין את האינטראקציות המולקולריות המקדמות כריכה.
מגבלה של פרוטוקולי מידול מולקולרי מבוססי מחשב היא התלות בפקודות ובתחביר ספציפיים. בעוד פרוטוקולים ביוכימיים עשויים להיות סובלניים לשינויים קטנים בהליך, חקירות מבוססות מחשב עשויות להניב מוצרים סופיים שונים לחלוטין אם ההליך אינו דבק מקרוב. הדבר חשוב במיוחד בעת שימוש בממשקי שורת פקודה שבהם נדרש תחביר ספציפי לתוכנית כדי להשיג פלט מסוים, ושינוי חסר משמעות לכאורה בפיסוק או באותיות רישיות עלול לגרום לפקודה להיכשל. ישנם אתרי Wiki ומדריכים שונים עבור כל תוכנית, שבהם משתמש יכול למצוא ולפתור בעיות של קלט שורת פקודה; המשתמש צריך לשים לב היטב לפרטים של תחביר הפקודה. למרות שרוב תוכניות ההדמיה המולקולרית כוללות פקודות ביטול, בשל המורכבות של הממשקים, פקודת הביטול לא תמיד הופכת בנאמנות את השלב האחרון שהוצא להורג. לכן, שמירת מצב העבודה הנוכחי לעתים קרובות מעודדת, במיוחד עבור משתמשים חדשים.
מגבלות נוספות יכולות לנבוע מהנתונים המשמשים ליצירת המודל עצמו. בעוד שהסטנדרטים הטבועים בבנק נתוני החלבון מבטיחים רמה מסוימת של עקביות, משתמשים בתוכניות הדמיה מולקולרית נתקלים לעתים קרובות בהשפעות בלתי צפויות בעיבוד חלבונים. ראשית, רוב המבנים נקבעים באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, המספקת דגם יחיד של החלבון; עם זאת, מבני NMR מורכבים לעתים קרובות מדגמים מרובים שניתן לדמיין אחד בכל פעם. שנית, מבנים שנקבעו מניסויי קריסטלוגרפיה או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניים עשויים להכיל אטומים שאת מיקומם לא ניתן להבהיר ולהופיע כניסולים בייצוגים מסוימים של החלבון. מבני חלבון עשויים להיות קונפורמציות חלופיות של שרשראות צד, אשר, כאשר מוצג עיבוד מקל, מופיעים כמו שתי קבוצות בולטות את אותו עמוד השדרה של חומצת אמינו. אפילו חלקים קצרים של עמוד השדרה עשויים להיות בעלי קונפורמציות חלופיות כאלה, ולעיתים ליגנדים ממוקמים באתר הפעיל ביותר מהתאמה מחייבת אחת.
עבור מבנה גביש, הקואורדינטות 3D שהופקדו כוללות את כל הרכיבים של היחידה האסימטרית, המספקת מספיק מידע כדי לשחזר את היחידה החוזרת של גבישי חלבון. לפעמים, מבנה זה יכיל שרשראות חלבון נוספות בהשוואה לצורה הפעילה ביולוגית של החלבון (למשל, מוטציית המוגלובין עוברית, PDB ID: 4MQK). לעומת זאת, ייתכן שתוכניות מסוימות לא יטענו באופן אוטומטי את כל השרשראות של היחידה הפעילה ביולוגית. לדוגמה, הפרוטאז הראשי SARS-CoV2 (מזהה PDB: 6Y2E) טוען מחצית מהעומעם הפעיל ביולוגית (המורכב משתי שרשראות חלבון) כאשר הוא מובא באמצעות הפקודות המתוארות בפרוטוקול זה ב- ChimeraX, PyMOL ו- Jmol. למרות ששינוי קל של הפקודה יטען את העמעם הפעיל ביולוגית, שיקול זה עשוי שלא להיות פשוט עבור משתמש תוכנית הדוגמנות טירון. בעיה אחרת שיכולה להתעורר היא בזיהוי האתר הפעיל או במצע עצמו. ניסויים קריסטלוגרפיים מתבצעים באמצעות מגוון מולקולות, אשר עשוי להיות מודל לתוך המבנה הסופי. לדוגמה, מולקולות סולפט עשויות לקשור אתרי כריכה פוספט באתר הפעיל, או שהם עשויים לאגד אזורים אחרים שאינם רלוונטיים למנגנון. מולקולות אלה עשויות לטשטש את הזיהוי הנכון של האתר הפעיל עצמו ואף עשויות להציע לתלמיד שהן חלק מהמנגנון.
ככל הנראה, המשתמש ירצה להחיל הליך זה על אתרים פעילים/מחייבים אחרים. כדי ליישם פרוטוקול זה בעבודה העתידית הכרוכה בניתוח של אתרים פעילים חדשים של חלבונים, המשתמש יצטרך לזהות אילו מהליגנדים הכבולים רלוונטיים לתפקוד. חלק מהליגנדים אינם קשורים לתפקוד החלבון, ובמקום זאת הם תוצאה של תנאי הממס או התגבשות המשמשים לביצוע הניסוי (למשל, יון האשלגן הנמצא במודל 3FGU). יש לזהות את ליגנדים המפתח על ידי התייעצות עם כתב היד המקורי. עם תרגול, ובמידת הצורך, הבנה של תחביר הפקודה של הקו, המשתמש יוכל ליישם את הפרוטוקול עבור תוכנית הדוגמנות הרצויה על כל אתר פעיל אנזים, ולדגמן מקרומולקולקולים אחרים לפי בחירתם.
זיהוי וניתוח של מצעים ולידות קשורים הוא מרכזי בהבהרת מנגנונים מולקולריים ומאמצי תכנון תרופות מבוססי מבנה, אשר הובילו ישירות לשיפורים בטיפולים למחלות, כולל תסמונת חיסונית נרכשת (איידס) ו- COVID-1947,48,49,50,51,52 . בעוד שתוכניות ויזואליזציה מולקולרית בודדות מציעות ממשקים וחוויות משתמש שונות, רובן מציעות תכונות דומות. חשוב לפיתוח אוריינות הדמיה ביומולקולרית כי סטודנטים ביוכימיה ברמה העליונה להכיר הדמיה מבנה ואת הכלים כדי ליצור תמונות כאלה4,20,53. זה מאפשר לתלמידים להתקדם מעבר לפרשנות של תמונות דו ממדיות בספרי לימוד ומאמרים בכתבי עת ולפתח בקלות רבה יותר השערות משלהם מנתונים מבניים54, אשר יכין מדענים מתפתחים לטפל בבעיות בריאות הציבור בעתיד ולשפר את ההבנה של תהליכים ביוכימיים.
לסיכום, פרוטוקול זה מפרט מידול אתרים פעיל באמצעות ארבע תוכניות מידול מובילות של מקרומולקולרית בחינם. הקהילה שלנו, BioMolViz, מאמצת גישה לא ספציפית לתוכנה לדוגמנות ביומולקולרית. נמנענו באופן ספציפי מביקורת או השוואה של תכונות התוכנית, אם כי משתמש שדגם כל תוכנית יגלה סביר להניח שהוא מעדיף היבטים מסוימים של מידול מקרומולקולרי בתוכנית אחת לעומת אחרת. אנו מזמינים את הקוראים להשתמש במסגרת BioMolViz, המפרטת את יעדי הלמידה והיעדים המבוססים על הדמיה ביומולקולרית הממוקדים בפרוטוקול זה, ולחקור משאבים להוראת ולמידה של הדמיה ביומולקולרית באמצעות אתר הקהילה BioMolViz http://biomolviz.org.

הבנת הייצוגים של העולם המולקולרי היא קריטית כדילהיות מומחהבמדעים הביומולקולריים 1 , כי הפרשנות של תמונות כאלה היא המפתח להבנת הפונקציה הביולוגית2. ההיכרות של הלומד עם macromolecules בדרך כלל מגיעה בצורה של תמונות דו ממדיות של קרום התא, אברונים, macromolecules, וכו 'אבל המציאות הביולוגית היא כי אלה הם מבנים תלת ממדיים, והבנה של המאפיינים שלהם דורש דרכים לדמיין ולחלץ משמעות מודלים 3D.
בהתאם, התפתחות האוריינות החזותית הביומולקולרית בקורסי מדעי החיים המולקולריים בחטיבה העליונה זכתה לתשומת לב, כאשר מספר מאמרים דיווחו על החשיבות והקשיים של הוראה והערכה של מיומנויות הדמיה1,3,4,5,6,7,8,9 . המענה למאמרים אלה היה עלייה במספר ההתערבויות בכיתה, בדרך כלל בתוך סמסטר במוסד אחד, שבו תוכניות ויזואליזציה מולקולרית ומודלים משמשים למיקוד מושגים קשים2,10,11,12,13,14,15 . בנוסף, החוקרים ביקשו לאפיין כיצד סטודנטים משתמשים בתוכניות הדמיה ביומולקולרית ו /או במודלים כדי לגשת לנושא מסוים16, 17,18,19. הקבוצה שלנו, BioMolViz, תיארה מסגרת המחלקת נושאים על גבי אוריינות חזותית למטרות למידה ויעדים כדי להנחות התערבויות כאלה20,21, ואנחנו מובילים סדנאות להכשיר את הפקולטה להשתמש במסגרת בעיצוב לאחור של הערכות כדי למדוד מיומנויות אוריינות חזותית22.
במרכז כל העבודה הזאת היא מיומנות קריטית: היכולת לתפעל מבנים של macromolecules באמצעות תוכניות להדמיה ביומולקולרית. כלים אלה פותחו באופן עצמאי באמצעות מגוון פלטפורמות; לכן, הם יכולים להיות ייחודיים למדי בפעולה ובשימוש שלהם. זה מחייב הוראות ספציפיות לתוכנית, וזיהוי של תוכנית שהמשתמש מרגיש בנוח עם חשוב כדי להקל על המשך היישום.
מעבר ליסודות הבסיסיים ביותר של מניפולציה של מבנים בתלת-ממד (סיבוב, בחירה ושינוי המודל), מטרה מרכזית היא לדגמן את האתר הפעיל של חלבון. תהליך זה מאפשר ללומד לפתח את הבנתו בשלושה נושאים מקיפים המתוארים על ידי מסגרת BioMolViz: אינטראקציות מולקולריות, ליגנדים / שינויים, ויחסי מבנה-פונקציה20,21.
ארבע אפשרויות פופולריות של תוכניות להדמיה ביומולקולרית כוללות: Jmol / JSmol23, iCn3D24, PyMOL25, ו UCSF כימרה26,27. אנו מעודדים את החדשים של כימרה להשתמש ב- UCSF ChimeraX, הדור הבא של תוכנית ההדמיה המולקולרית של כימרה, שהיא הגרסה הנתמכת כיום של התוכנית.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד להשתמש בכל אחת מארבע התוכניות הללו כדי לדגמן את האתר הפעיל של גלוקוקינאז אנושי עם קומפלקס אנלוגי מצע מאוגד (מזהה PDB: 3FGU), ולהציג מדידות כדי להמחיש אינטראקציות מחייבות ספציפיות28. המודל מייצג קומפלקס קטליטי של האנזים. כדי ללכוד את האתר הפעיל במצב טרום קטליזה, אנלוגי לא הידרוליזה של ATP היה קשור לאתר הפעיל glucokinase. אסתר חומצה-אדנילט זרחנית זו (ANP) מכילה קשר זרחן-חנקן במקום הצמדת החמצן הזרחן הרגילה במיקום זה. האתר הפעיל מכיל גם גלוקוז (מסומן BCG בדגם) ומגנזיום (מסומן MG). בנוסף, יש יון אשלגן (K) במבנה, הנובע אשלגן כלורי המשמש ממס התגבשות. יון זה אינו קריטי לתפקוד ביולוגי והוא ממוקם מחוץ לאתר הפעיל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig01.jpg"> איור 1: מבני ATP/ANP. מבנה אדנוסין טריפוספט (ATP) בהשוואה לאסתר חומצה אדנילט פוספונמית (ANP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרוטוקול מדגים את הבחירה של ליגנדים קשורים של קומפלקס אנלוגי מצע וזיהוי של שאריות אתר פעיל בתוך 5 Å של המתחם הכרוכות, אשר לוכד חומצות אמינו ומולקולות מים מסוגל לעשות אינטראקציות מולקולריות רלוונטיות, כולל אינטראקציות הידרופובי ואן דר Waals.
התצוגה מופעלת בתחילה כדי להראות את רוב החלבון בייצוג מצויר, עם שאריות חומצות אמינו האתר הפעילות בייצוג מקל כדי להראות את האטומים הרלוונטיים של החלבון ולהדגיש את האינטראקציות המולקולריות. לאחר שלב 3 של הפרוטוקול עבור כל תוכנית, ייצוגים אלה יושמו ותצוגת החלבון דומה בתוכניות על פני תוכניות (איור 2). בסוף הפרוטוקול, קריקטורת החלבון מוסתרת כדי לפשט את התצוגה, ולהתמקד באתר הפעיל.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig02.jpg"> איור 2:השוואת מבנה בין תוכניות. השוואה של המבנה של 3FGU בכל תוכנית לאחר השלב התאמת הייצוג (שלב 2 או 3 של כל פרוטוקול). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
צביעת CPK מוחלת על חומצות אמינו האתר הפעיל ולידות קשורות29,30. ערכת צביעה זו מבחינה אטומים של יסודות כימיים שונים במודלים מולקולריים המוצגים בתור, מקל, כדור ומקל, וייצוגים ממלאי מקום. מימן הוא לבן, חנקן הוא כחול, חמצן הוא אדום, גופרית היא צהובה, וזרחן הוא כתום בתכנית הצביעה CPK. באופן מסורתי, שחור משמש לפחמן, אם כי בשימוש מודרני, צביעת פחמן עשוי להשתנות.
אטומי מימן אינם נראים במבני קריסטל, אם כי כל אחת מהתוכניות הללו מסוגלת לחזות את מיקומם. הוספת אטומי המימן למבנה מקרומולקולרי גדול יכולה לטשטש את התצוגה, ולכן הם אינם מוצגים בפרוטוקול זה. בהתאם לכך, קשרי מימן יוצגו על ידי מדידה ממרכז שני הטרואטומים (למשל, חמצן לחמצן, חמצן לחנקן) במבנים אלה.
סקירות כלליות של תוכניות ממשקי משתמש גרפיים להורדה (GUIs): PyMOL (גירסה 2.4.1), כימראקס (גירסה 1.2.5) ו- Jmol (גירסה 1.8.0_301) הם כלי מידול מולקולריים מבוססי GUI. שלושת הממשקים האלה כוללים שורות פקודה לקלט קוד מוקלד; רבות מאותן יכולות זמינות באמצעות תפריטים ולחצנים ב- GUI. תכונה נפוצה בשורת הפקודה של תוכניות אלה היא שהמשתמש רשאי לטעון ולבצע מחדש פקודות קודמות באמצעות מקשי החצים למעלה ולמטה בלוח המקשים.
GUIs מבוסס אינטרנט: iCn3D (I-see-in-3D) הוא מציג מבוסס WebGL לצפייה אינטראקטיבית של מבנים וכימיקלים תלת-ממדיים של מקרומולקולריים באינטרנט, ללא צורך בהתקנת יישום נפרד. הוא אינו משתמש בשורת פקודה, למרות שגירסת האינטרנט המלאה כוללת יומן פקודות הניתן לעריכה. JSmol היא גירסת JavaScript או HTML5 של Jmol לשימוש באתר אינטרנט או בחלון דפדפן אינטרנט, והוא דומה מאוד בפעולה ל- Jmol. ניתן להשתמש ב- JSmol כדי ליצור ערכות לימוד מקוונות, כולל הנפשות.
פרוטאופדיה31,32, FirstGlance ב Jmol33, וממשק האינטרנט JSmol (JUDE) בבית הספר להנדסה של מילווקי למידול ביומולקולרי הם דוגמאות לסביבות עיצוב מקוונות מבוססות Jmolכאלה 34. ויקי Proteopedia הוא כלי הוראה המאפשר למשתמש לדגמן מבנה macromolecule וליצור דפים המציגים מודלים אלה בתוך אתר35. כלי העריכה של סצנות Proteopedia, שנבנה באמצעות JSmol, משלב GUI עם תכונות נוספות שאינן זמינות ב- Jmol GUI.
Jmol ו- iCn3D מבוססים על שפת התכנות Java; JSmol משתמשת ב- Java או ב- HTML5, ו- PyMOL ו- ChimeraX מבוססות על שפת התכנות של פייתון. כל אחת מהתוכניות האלה טוענת קבצי מאגר נתוני חלבון, שניתן להוריד מבנק נתוני החלבון RCSB תחת מזהה PDB אלפאנומרי בן 4 ספרות36,37. סוגי הקבצים הנפוצים ביותר הם קבצי מאגר נתוני חלבון (PDB) המכילים את סיומת .pdb וקובץ מידע קריסטלוגרפי (CIF או mmCIF) המכיל את סיומת .cif. CIF המחליף את PDB כסוג הקובץ המוגדר כברירת מחדל עבור מאגר נתוני החלבון, אך שתי תבניות הקובץ פועלות בתוכניות אלה. תיתכנו הבדלים קלים באופן שבו הרצף/מבנה מוצגים בעת שימוש ב- CIF בניגוד לקבצי PDB; עם זאת, הקבצים פועלים באופן דומה וההבדלים לא יטופלו בפירוט כאן. מסד הנתונים של מידול מולקולרי (MMDB), תוצר של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (NCBI), הוא תת-קבוצה של מבני PDB שאליהם נקשר מידע קטגורי (למשל, תכונות ביולוגיות, תחומי חלבון שמורים)38. iCn3D, מוצר של NCBI, מסוגל לטעון קבצי PDB המכילים את נתוני MMDB.
כדי להציג מודל, המשתמש יכול להוריד את הקובץ הרצוי מהדף הייעודי Protein Data Bank עבור המבנה (לדוגמה, https://www.rcsb.org/structure/3FGU), ולאחר מכן להשתמש בתפריט קובץ נפתח של התוכנית כדי לפתוח את המבנה. כל התוכניות מסוגלות גם לטעון קובץ מבנה ישירות דרך הממשק, ושיטה זו מפורטת בפרוטוקולים.
כימרהX, Jmol ו- PyMOL GUIs מכילים כל אחד מהם אחד או יותר של הקונסולה שניתן לשנות את גודלו על-ידי גרירת הפינה. iCn3D ו- JSmol כלולים לחלוטין בדפדפן אינטרנט. בעת שימוש ב-iCn3D, ייתכן שהמשתמש יצטרך לגלול בתוך החלונות המוקפצים כדי לחשוף את כל פריטי התפריט, בהתאם לגודל המסך והרזולוציה.
הפרוטוקולים המפורטים כאן מספקים שיטה פשוטה להצגת האתר הפעיל של האנזים באמצעות כל תוכנית. יש לציין כי קיימות דרכים מרובות לביצוע השלבים בכל תוכנית. לדוגמה, ב- ChimeraX, ניתן לבצע את אותה משימה באמצעות תפריטים נפתחים, סרגל הכלים בחלק העליון או שורת הפקודה. משתמשים המעוניינים ללמוד תוכנית ספציפית בפירוט מוזמנים לחקור את ההדרכות המקוונות, המדריכים והוויקי הזמינים עבור תוכניות אלה39,40,41,42,43,44,45,46.
מדריכים וערכות לימוד קיימות עבור תוכניות אלה מציגים את הפריטים בפרוטוקול זה כמשימות נפרדות. כדי להציג אתר פעיל, על המשתמש לסנתז את הפעולות הנדרשות מהמדריכים וערכות הלימוד השונות. כתב יד זה מעצים את ערכות הלימוד הקיימות הזמינות על-ידי הצגת פרוטוקול ליניארי למידול אתר פעיל עם תוויות עם אינטראקציות מולקולריות, ומספק למשתמש לוגיקה למידול אתרים פעיל שניתן להחיל על מודלים ותוכניות אחרים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig03.jpg"> איור 3: כימרקס GUI. ממשק ממשק ממשק ממשק משתמש גרפי של ChimeraX עם התפריטים הנפתחים, סרגל הכלים, מציג המבנה ו שורת הפקודה המסומנים בתווית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig04.jpg"> איור 4: iCn3D GUI. iCn3D ממשק ממשק GUI עם התפריטים הנפתחים, סרגל הכלים, מציג המבנים, יומן הפקודות, בחירת ערכות מוקפצות ותפריטים מוקפצים של רצף וביאורים המסומנים בתווית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig05.jpg"> איור 5: ג'מול מג"ב. ממשק Jmol GUI עם התפריטים הנפתחים, סרגל הכלים, מציג המבנה, התפריט המוקפץ וקו המסוף/פקודה המסומנים בתווית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig06.jpg"> איור 6: PyMOL GUI. ממשק PyMOL GUI עם התפריטים הנפתחים, מציג המבנים, שמות/לוח אובייקטים, תפריט פקדי עכבר ושורה פקודה עם תווית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ChimeraX (Version 1.2.5) https://www.rbvi.ucsf.edu/chimerax/</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCn3D (web-based only: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/full.html)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java (for Jmol) https://java.com/en/download/</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jmol (Version 1.8.0_301) http://jmol.sourceforge.net/</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL (Version 2.4.1 - educational): https://pymol.org/2 educational use only version: https://pymol.org/edu/?q=educational</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling an enzyme active site using molecular visualization freeware

כישורי הדמיה ביומולקולריים הם בעלי חשיבות עליונה להבנת מושגי מפתח במדעי הביולוגיה, כגון יחסי מבנה-פונקציה ואינטראקציות מולקולריות. תוכניות שונות מאפשרות ללומד לתפעל מבנים תלת-ממדיים, ומודל ביומולקולרי מקדם למידה פעילה, בונה מיומנויות חישוביות ומגשר על הפער בין תמונות דו-ממדיות של ספרי לימוד לשלושת ממדי החיים. מיומנות קריטית בתחום זה היא לדגמן אתר פעיל בחלבון, המציג חלקים של המקרומולקולה שיכולים לקיים אינטראקציה עם מולקולה קטנה, או ליגנד, באופן שמראה אינטראקציות מחייבות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תהליך זה באמצעות ארבע תוכניות מידול מקרומולקולרי זמין באופן חופשי: iCn3D, Jmol / JSmol, PyMOL, ו UCSF ChimeraX. מדריך זה מיועד לסטודנטים המבקשים ללמוד את היסודות של תוכנית ספציפית, כמו גם מדריכים המשלבים מודלים ביומולקולריים בתוכנית הלימודים שלהם. הפרוטוקול מאפשר למשתמש לדגמן אתר פעיל באמצעות תוכנית ויזואליזציה ספציפית, או לדגום כמה מהתוכניות החינמיות הזמינות. המודל שנבחר לפרוטוקול זה הוא גלוקוזקינאז אנושי, איזופורם של האנזים הקסוקינאז, אשר מזרז את הצעד הראשון של גליקוליזה. האנזים קשור לאחד המצעים שלו, כמו גם אנלוגי מצע לא תגובתי, המאפשר למשתמש לנתח אינטראקציות בקומפלקס הקטליטי.

פרוטוקול שבוצע בהצלחה עבור כל אחת מהתוכניות יביא למודל מולקולרי המוגדל באתר הפעיל, עם שאריות אתר פעילות ולידות המוצגות כמקלות, קריקטורת החלבון מוסתרת ולידות המוצגות עם ערכת צבעים מנוגדת. שאריות חומצת אמינו אינטראקציה צריך להיות מתויג עם המזהים שלהם, ו מימן מליטה ואינטראקציות יוניות מוצג עם קווים. נוכחותן של תכונות אלה יכולה להיקבע על ידי בדיקה חזותית של המודל.
כדי להקל על בדיקה זו ולאפשר למשתמש לקבוע אם הוא ביצע את שלבי הפרוטוקול כראוי, סיפקנו דמויות מונפשות המציגות תמונה של המבנה לאחר כל שלב. עבור כימרהX, iCn3D, Jmol ו- PyMOL, זה מאויר באיורים 7-10, בהתאמה.
איור 7: פלט פרוטוקול כימרהX. דמות אנימציה הממחישה את השלבים 1.1-1.8 של פרוטוקול כימרהX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%207.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
איור 8: פלט פרוטוקול iCn3D. איור מונפש הממחיש את השלבים 2.1-2.8 של פרוטוקול iCn3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%208.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
איור 9: פלט פרוטוקול Jmol. דמות אנימציה הממחישה את השלבים 3.1-3.8 של פרוטוקול Jmol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%209.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
איור 10: פלט פרוטוקול PyMOL. דמות אנימציה הממחישה את השלבים 4.1-4.8 של פרוטוקול PyMOL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/Figure%2010.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.</a>
השגיאה הנפוצה ביותר שיכולה להשפיע על התוצאה של פרוטוקולים אלה היא בחירה שגויה, וכתוצאה מכך חלק מהמבנה מוצג בעיבוד לא רצוי. זוהי בדרך כלל תוצאה של לחיצה שגויה, על המבנה עצמו או באחד מלחצני תפריט התצוגה. דוגמה לתוצאה תת-אופטימלית תהיה מודל המכיל שאריות מחוץ לאתר הפעיל המוצג כמקלות. המשתמש יכול להתחיל לנתח אם שגיאה זו התרחשה על-ידי בדיקה חזותית של השאריות המוצגות כמקלות והבטחה שהם נמצאים בקרבת ליגנדים הפעילים של האתר. שיטה מתקדמת להערכת האם השאריות המוצגות נמצאות בטווח של 5Å מהליגנדים הפעילים של האתר היא להשתמש בכלי המדידה המובנים בכל תוכנית כדי למדוד את המרחק בין ליגנד סמוך לשאריות האתר הפעילות. כלי המדידה הם מעבר להיקף כתב היד הזה; עם זאת, אנו מעודדים משתמשים מעוניינים לחקור את ערכות הלימוד המקוונות הרבות המפרטות סוג זה של ניתוח.
אנו מציגים דוגמה ספציפית לביצוע תת-אופטימלי של פרוטוקול זה, הנובעת מלחיצה שגויה בחלונית שמות/אובייקטים ב- PyMOL. שגיאה זו מציגה את החלבון כולו כמקלות, במקום להציג רק את האתר הפעיל באמצעות ייצוג זה, כפי שמודגם באיור 11.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig11.jpg"> איור 11: תוצאה שלילית. דוגמה לתוצאה שלילית. בחירת קריקטורה מלאה ב- PyMOL והצגת מקלות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדי לפתור בעיות, המשתמש יצטרך להסתיר את המקלות עבור הדגם כולו (שכותרתו 3FGU בחלונית השמות/האובייקטים), ולאחר מכן להציג את ייצוג המקל עבור הבחירה בשם "פעילה", באמצעות לחצנים/פקודות הסתרה והצגה ב- PyMOL. שחזור המודל מסוג זה של שגיאה הוא פשוט יחסית ברגע שהמשתמש מסוגל ליצור בחירות מתאימות עבור חלקים שונים של המודל ולהציג ולהסתיר אותם ביעילות. מפתה להפעיל מחדש את הפרוטוקול ולעבוד על השלבים בפעם אחרת; עם זאת, אנו מעודדים את המשתמש לא לפחד ללכת "מחוץ לתסריט" ולהתנסות עם המודל. מניסיוננו, עבודה באמצעות שגיאות תצוגה מקלה על התקדמות בהבנת תוכנית הדוגמנות.
תצוגה זה לצד זה של הפלט הסופי מפרוטוקול שבוצע בהצלחה עבור כל תוכנית מוצגת באיור 12. התצוגות מכוונות באופן דומה כדי לאפשר למשתמש להשוות את המראה של המודלים שנוצרו בתוכניות שונות.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63170/63170fig12.jpg"> איור 12: השוואת מבנה סופית בין תוכניות. השוואה של המבנה של כל עיבוד אתר פעיל בסוף הפרוטוקול. A: כימרהקס, B: iCn3D, ג: Jmol, D: PyMOL. תווית האתר הפעילה PyMOL כוללת את כל שאריות האתר הפעילות ואת הליבנדים. לתפוקות האחרות יש רק שרשראות צד מימן מתויגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63170/63170fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware at JoVE.com

Modeling an Enzyme Active Site using Molecular Visualization Freeware

מיומנות מרכזית בדוגמנות ביומולקולרית היא הצגת וביאור אתרים פעילים בחלבונים. טכניקה זו מודגמת באמצעות ארבע תוכניות פופולריות בחינם להדמיה מקרומולקולרית: iCn3D, Jmol, PyMOL, ו UCSF כימרהX.

מידול אתר פעיל אנזים באמצעות תוכנה חופשית להדמיה מולקולרית

Biomolecular visualization skills are paramount to understanding key concepts in the biological sciences, such as structure-function relationships and ...

הדמיה של מקרומולקולים ביולוגיים היא מיומנות קריטית לסטודנטים ואנשי מקצוע במדעי הביולוגיה. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לדגמן את האתר הפעיל של האנזים גלוקוקינאז באמצעות ארבע תוכניות זמינות באופן חופשי למידול מולקולרי. מדריך זה מדגיש מספר שלבים של הפרוטוקול עבור כל תוכנית, הכולל בחירת ליגנדים מאוגדים ושימוש בליגנדים להצגת חומצות אמינו ומולקולות מים בתוך חמישה אנגסטרומים.המידע התומך של כתב יד זה מכיל וידאו ייעודי לכל תוכנית, המפרט את כל שלבי הפרוטוקול בהסבר נוסף. המבנה יהיה מודל PDBID. 3FGU מייצג את הקומפלקס הקטליטי של האנזים גלוקוקינאז.האתר הפעיל של האנזים מאוגד לשניים מהמצעים שלו, בטא-די-גלוקוז, אשר נתן את המזהה BGC ויון מגנזיום, MG. בנוסף, אנלוגי מצע זה, חומצה זרחנית אמינו זרחן, אסתר אדנילט, ANP קשור לאתר הפעיל glucokinase. זה אנלוגי לא הידרוליזה של אדנוסין טריפוספט, ATP מונע את תגובת זרחן להתרחש, אשר לוכד את המתחם האתר הפעיל לפני קטליזה. הממשק של תוכנית מידול UCSF ChimeraX מכיל תפריטים נפתחים, סרגל כלים, מציג המבנה ופס פקודה.נתחיל את הפרוטוקול בשלב 1.4, נבחר שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל. כדי לבחור את הליגנדים לחץ על הסט שליטה ולחץ על כל אטום או קשר בכל אחד משלושת הליגנדים. הקש על מקש החץ למעלה עד שכל שלושת הליגנדים מסומנים בזוהר ירוק.הגדר את הבחירה לשימוש עתידי על-ידי לחיצה בתפריט הנפתח, בחר הגדר בורר, הקלד ליגנדים עבור שם הבחירה ולחץ על אישור. שוב, באמצעות תפריט בחירה, בחר אזור. החלף מצב זה לשאריות וודא שהממיר העליון מסומן.לחץ על אישור. שים לב לחלקים של הקריקטורה בתוך חמישה אנגסטרומים של ליגנדים אלה מודגשים. כדי להציג את שרשראות הצד כמקלות ולהציג את האתר הפעיל מולקולות מים להשתמש בתפריט קשרים אטומים פעולות כדי להראות אותם.או להפעיל אותם עם לחצנים אלה כאן. כדי לנקות את הבחירה, לחץ במקום כלשהו בשטח הריק. התוצאה הסופית של פרוטוקול זה צריכה להיות מודל עם האתר הפעיל של החלבון והליגנדים המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד.אינטראקציות כריכה קוטביות מרכזיות מוצגות עם קווים מנוקדים וחלק מהשאריות ליצירת אנשי קשר מסומנות בתווית. ממשק iCn3D מכיל תפריטים נפתחים, מציג המבנה ויומן פקודות. תצוגה זו מציגה את התפריטים המוקפצים של ערכות ורצף וביאורים, המופיעים כאשר המשתמש מבצע פקודות הדורשות אותם.נתחיל את הפרוטוקול בשלב 2.4, נבחר שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל. כדי לבחור את הליגנדים, השתמש בתפריט הנפתח הנבחר ולחץ על בחר בתת-ממד, ודא שהשאריות נבדקות. לחיצה על כפתור alt במחשב או על לחצן האפשרויות ב-Mac, לחץ/י על הליגנד הראשון.לאחר מכן לחץ על בקרה ולחץ על שני ליגנים הנותרים כדי להוסיף אותם לבחירה. שמור את הבחירה באמצעות התפריט הנפתח, לחץ על בחר, שמור בחירה, הזן שם ולחץ על שמור. התפריט הנפתח Select sets יופיע כעת כאשר שלושת הליגנדים נבחרו.עכשיו בחר את השאריות בתוך חמישה אנגסטרום של ליגנדים. השתמש בתפריט הנפתח בחר לפי מרחק. בתפריט המוקפץ שמופיע, שנה את חנית הפריט השניה ברדיוס לחמישה אנגסטרומים על-ידי הקלדה בבלוק, לחץ על תצוגה.ולאחר מכן סגור את החלון על-ידי לחיצה על ה- X בפינה השמאלית העליונה. שמור את חמשת האתר הפעיל של אנגסטרום על-ידי לחיצה על התפריט הנפתח, בחר שמור בחירה והשתמש בלוח המקשים כדי להזין שם. לאחר מכן לחץ על שמור.כעת צרו בחירה חדשה המשלבת בין שתי הקבוצות. ניתן לשלב אותם בתפריט המוקפץ 'ערכות בחירה'. במחשב, לחץ על שליטה בשתי ערכות או בפקודה Mac.שוב, לחץ על התפריט הנפתח, בחר שמור בחירה והקלד שם חדש ולאחר מכן לחץ על שמור. כדי להציג אינטראקציות כגון קשרי מימן, השתמש בתפריט הניתוח ובחר אינטראקציות. אנחנו נהיה מעוניינים רק בקשרי מימן וגשרי מלח כאן.אז נבטל את הסימון של שאר אלה. נבחר שלושה ליגנדים. ולסט השני, השאריות בתוך חמישה אנגסטרום.לחץ על אינטראקציות תצוגה תלת-ממדיות וסגור את החלון. זה מראה חלק מהשאריות שמתקשרות אבל זה לא מראה את כל חמשת האתרים הפעילים של אנגסטרום. כדי להציג את זה ישתמש שוב בתפריט ערכות בחירה.לחץ על חמישה אנגסטרום מלא ולאחר מכן בתפריט הנפתח, לחץ על סגנון שרשראות צד, מקלות. כדי להחיל צביעת CPK, לחץ על התפריט הנפתח צבע ולחץ על אטום. התוצאה הסופית של הפרוטוקול צריכה להיות מודל שנראה כך עם האתר הפעיל של החלבון והליגנד המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד.אינטראקציות איגוד חשובות מוצגות עם קווים מנוקדים וכל השאריות באחת הבחירות שנוצרו במהלך הפרוטוקול מסומנות בתווית. ממשק Jmol מכיל תפריטים נפתחים, סרגל כלים, מציג המבנה, תפריט מוקפץ וקונסול Jmol המכיל את שורת הפקודה. אנחנו מתחילים את פרוטוקול Jmol בשלב 3.4, בחירת שאריות בתוך חמישה אנגסטרום כדי להגדיר אתר פעיל.קונסולת Jmol היא הדרך הטובה ביותר לבחור את השאריות בתוך חמישה אנגסטרום. הקלד פקודה זו כדי לבחור שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים של שלושת הליבנדים. 193 אטומים נבחרים אך אלה אינם מייצגים את שאריות חומצת האמינו המלאה.כדי לבחור אותם, השתמש בפקודה מוקלדת, בחר בתוך (קבוצה, נבחר) והקש Enter. שים לב שהילה נוספת של בחירה מופיעות. כדי להציג שאריות אלה כמקלות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להציג את התפריט המוקפץ, לרחף מעל סגנון, לתכנן ולאחר מכן לחץ על מקלות.שימו לב שיש כאן עדיין כמה הילה ריקה. אלו מולקולות המים באתר הפעיל. כדי לבחור רק את מולקולות המים, אנו יכולים לבצע מחדש פקודה זו ולאחר מכן לשנות אותה.לחץ בתוך המסוף ולאחר מכן השתמש במקשי החצים למעלה כדי למצוא פקודה זו ולחץ על Enter כדי לבצע אותה מחדש. כדי להציג את מולקולות המים כאטומים, אנחנו רוצים להסיר את הבחירה של ליגנד ואת החלבון. נקליד שתי פקודות כדי לעשות את זה.הליבגנים שלנו נחשבים לקבוצות הטרוסקסואליות, אבל מים נחשבים גם לאחד. אז בתוך הפקודה הזאת, אנחנו צריכים להגדיר שאנחנו לא מסירים את המים. לחץ על הזן ועכשיו רק מולקולות המים נבחרות.לחץ על תפריט התצוגה הנפתחת, רחף מעל אטום ולחץ על 20% מרדיוס ואן דר ואלס. יון המגנזיום הירוק עדיין מוצג כמקלות. בדרך כלל יונים מוצגים כספירות.לחץ במסוף Jmol ולאחר מכן הקלד בחר MG ולאחר מכן מילוי שטח 50%הליגנדים בתוך שרשראות נצבעים באופן זהה. כדי להבדיל ביניהם, כדאי לצבוע מחדש את הליגנדים. בקונסולה, אני אבצע פקודה מרובת שורות, שהעתקתי-הדבקה מגיליון לרמות שאני מרחיב על בסרטון המשלים Jmol.התוצאה של פרוטוקול זה צריכה להיות מודל שנראה כך עם האתר הפעיל של החלבון המוצג כמקלות. והליגנדים הראו לנו מקלות בערכת צבעים רכה יותר. קווים צהובים מציינים את אינטראקציות האיגוד ושאריות בודדות מסומנים כרצונם.ממשק PyMOL מכיל תפריטים נפתחים, מציג המבנה, לוח האובייקטים שמות ותפריט פקדי העכבר. שורת הפקודה הראשית מסומנת גם באיור זה. אנחנו מתחילים את הפרוטוקול הראשוני בשלב 4.4, בחירת שאריות בתוך חמישה אנגסטרומים כדי להגדיר אתר פעיל.כדי לבחור את הליגנדים לחץ על כל אחד מהם. בחירה חדשה מוקפצת, שניתן לשנות את שמה על-ידי לחיצה על לחצן A. באמצעות המקלדת, מחק את האותיות sele והקלד ליגנים במקומם.הקש Enter. אנחנו יכולים להשתמש בבחירה זו כדי להגדיר את האזור סביבו. התחל על-ידי לחיצה על לחצן A ובחר את פריט התפריט הכפול.בבחירה חדשה זו, sel01, לחץ על A ובחר את שינוי שם פריט התפריט. באמצעות לוח המקשים, מחק את האותיות הקיימות והקלד פעיל. זה עדיין בחירת שלושת הליבנדים שלנו כך שנצטרך לשנות אותו שוב, באמצעות לחצן פעולות A.לחץ על הלחצן, בחר שנה והרחב את הבחירה בחמישה אנגסטרום. עכשיו תפסנו את הליגנדים ואת השאריות בתוך חמישה אנגסטרום. לחצן S על ה- S מייצג את ההצגה.לחץ על זה כדי להציג את החלבון בדרכים שונות. נראה את שוש זה כמקלות. לחץ בשטח הריק כדי לנקות את הבחירה.זה כבש את חומצות האמינו בתוך חמישה אנגסטרום אבל לא את המים. אנחנו יכולים שוב, לשכפל את הבחירה ועכשיו לשנות אותו כדי לבחור רק את המים. בלחצן הפעולות A, שכפל.בחירה 2 מופיעה. בואו לשנות את זה למים פעילים. הפעם נשתמש בלחצן A כדי לשנות, מסביב כדי לבחור את האטומים סביב הבחירה שלנו.אטומים בתוך ארבעה אנגסטרום. זה בחר את המים אבל גם כמה אטומים של שרשראות הצד. כדי לשנות זאת עוד יותר, השתמש בלחצן A כדי לשנות ולהגביל לממס.עכשיו אנחנו יכולים לראות רק את מולקולות המים מוארות. שוב בלחצן A, אנו יכולים להחיל קביעה מוגדרת מראש. בחר קביעה מוגדרת מראש, כדור ומקל ועכשיו מולקולות המים מוצגות כדורים.התוצאה הסופית של הפרוטוקול היא מודל שנראה כך עם האתר הפעיל בליגנדים המוצגים כמקלות צבועים באופן מנוגד. קווי מקף צהובים מציגים אינטראקציות איגוד קוטביות ושאריות בודדות מסומנות באמצעות הבחירות שנוצרו בחלונית האובייקט שמות. שגיאות בביצוע הפרוטוקול עלולות להוביל לתוצאות תת-אופטימליות.לדוגמה, החלבון כולו מוצג כמקלות. כדי לפתור בעיות, המשתמש יצטרך תחילה להסתיר את ייצוג המקל עבור המבנה כולו. ולאחר מכן הצג מחדש את ייצוג המקל עבור האובייקט הנקרא פעיל בלבד באמצעות לחצן S.כאן המודלים שנוצרו באמצעות כל תוכנית מוצגים זה לצד זה. למרות שיש הבדלים בתצוגה של האנזים, אותן תכונות מרכזיות ואינטראקציות ניתן לראות בכל אחד מארבעת הדגמים. משתמש המעוניין לשלוט באחת התוכניות המכילות שורת פקודה מעוניין ללמוד להחיל ולשנות פקודות מוקלדות.כפי שרמזתי בפרוטוקול Jmol, כלי שימושי הוא גיליון לרמות פקודה. קובץ טקסט רגיל המכיל קודים הנמצאים בשימוש תכוף להפניה. כדי להפוך למשתמש מתקדם, כדאי להבין אילו חלקים של הפרוטוקול ניתן להתאים ולשנות.עם תרגול פרוטוקולים אלה ניתן להחיל מודל כל אתר פעיל אנזים של עניין.