我们要感谢阿里博士和植物分子诊断实验室以及佐治亚大学的平升吉博士，他们的领导和支持帮助建立了我们的Fon计划。

1. 通过浸根法（RDM）确定种族
<ol><li>实验环境的准备<ol>
<li>由于症状表达高度依赖于环境条件，因此将植物保持在受控区域。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1）。<ol>
<li>将温度设置为26-28°C，相对湿度设置为50-75%，并设置16小时的光周期，以确保植物足够的生长和健康。 注意：为了防止缺氧，幼苗枯萎和/或种子腐烂，不要在幼苗周围过度浇水?...

已经提出了三种种族分型方法。这些方法中的每一种都最适合特定的问题和实验条件。侵扰的籽粒接种方法（土壤侵扰）可能更简单，更直接，使其对于评估致病性30特别有用。使用这种方法进行简单的种族分型是非常有效的。然而，应用该方法来确定特定品种的抗性可能具有挑战性，因为每种植物可能不面临相同程度的感染或暴露，并且可能需要同样高水平的疾病来测试感兴?...

构成 尖孢镰刀菌 物种复合物（FOSC）的土生真菌是影响性的半生物养植物病原体，可导致多种作物的严重疾病和产量损失1。由 F. oxysporum f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病在过去 几十年中在世界各地的范围、发病率和严重程度都在增加2，3.在幼苗中，镰刀菌枯萎病的症状通常类似于阻尼。在较老的植物中，叶子变成灰色，绿化和坏死。最终，植物的枯萎进展为植物完全崩溃和死亡4。直接产量损失是由于植物的症状和死亡而发生的，而间接产量损失可能是由于太阳损害造成的，由叶面冠层5的消除引起的。在 F. oxysporum 中从未观察到有性繁殖和相关生殖结构。然而，病原体产生两种类型的无性孢子，微分生孢子和大分生孢子，以及称为衣原体孢子的更大的长期生存结构，可以在土壤中存活多年6。
FOSC根据观察到的宿主范围被分类为特殊形态，通常限于一个或几个宿主物种1。虽然最近的研究表明，这种物种复合物可能是15种不同物种的复合物，但感染西瓜的特定物种目前尚不清楚7种。 F. oxysporum f. sp. niveum （Fon） 是专门感染 Citrullus lanatus 或驯化西瓜8，9 的菌株组的名称。在大多数致病性特产中的 F. oxysporum 菌株在其遗传成分和对宿主物种的毒力方面显示出一定程度的多样性。例如，一种菌株可能感染宿主的所有栽培品种，而另一种菌株可能只感染更易感的品种。为了解释这种变异，这些群体根据进化关系或共同的表型特征被非正式地分为种族。在Fon中，根据其对一组精选西瓜品种的致病性，对4个种族（0，1，2和3）进行了表征，最近发现了10个种族3。
尽管存在这种明显的多样性，但孢子或菌丝的形态在Fon种族之间无法区分，这意味着需要分子或表型测定来鉴定分离株的独特种族11。分子研究已经确定了一些遗传差异。例如，分泌在木质部（SIX）效应子中的作用已经在 F. oxysporum 中研究了多年，其中一些效应子已经位于水平基因转移过程中交换的染色体上12。例如，SIX6在Fon种族0和1中找到，但在种族213中找不到。六个效应子与 F. oxysporum f. sp . lycopersici 和 F. oxysporum f. sp. cubense的致病性有关，它们分别导致番茄和香蕉上的镰刀菌枯萎病，分别为14，15，16，17。对菠菜上的镰刀菌枯萎病病原体F . oxysporum f. sp. spiniciae菌株的SIX效应谱的分析使得分类能够准确反映遗传和表型多样性18。然而，Fon种族的毒力机制之间的差异目前尚不完全清楚，并且使用它们时开发的分子测定显示出不一致和不准确的结果19。因此，感染检测的表型结果是目前对分离株进行分类的最佳方法。
F. oxysporum 最初通过根部感染宿主，然后向上进入木质部20。这使得直接接种特定宿主品种的根系成为进行种族分型的有效方法，并且是根浸和托盘浸渍接种方法21的基础。当不感染宿主时， F. oxysporum 居住在土壤中，并且可以保持休眠多年。在土壤中从感兴趣的田地种植易感的西瓜品种是测试Fon存在的一种方法。将这种方法扩展到包括故意用Fon侵扰的土壤中具有不同已知抗性水平的品种也是进行种族分型的好方法（表1），并且是受感染的内核播种方法的基础。改进的托盘浸渍方法是原始托盘浸渍方法的变体，该方法允许高通量的竞赛类型，其中可以快速研究许多植物和田间分离株22。快速和成功的种族分型生物测定的重要因素包括使用已记录对不同病原体种族的抗性差异的品种，确保接种物在感染期间具有生物活性和丰富性，保持对病原体和宿主都有利的环境，以及使用一致的疾病严重程度或发病率评级系统。本文描述了基于上述原理的根浸23，24，出没的内核播种25，26和改进的托盘浸渍22 表型种族分型方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Fuller&#8217;s Earth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F200-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass Erlenmeyer Flask</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>4980-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL falcon tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL graduated cylinder</td>
			<td>Lab Safety Supply</td>
			<td>41121805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Eppendorf Conical Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-413-921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil wrap</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>587192290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-391-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell spreaders</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>Lions Services, Inc</td>
			<td>8305-01-125-0725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic dishes</td>
			<td>Visions Wave</td>
			<td>999RP6CLSS</td>
			<td>~15 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps</td>
			<td>Shroom Supply</td>
			<td></td>
			<td>6&#34; for small bag, 8&#34; for medium bag, 10&#34; for large bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-456-885</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A4094</td>
			<td>100%, then combine with water to make 70% for use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent Tube Lights</td>
			<td>MaxLume</td>
			<td>Model T5</td>
			<td>2800 K Color Temperature, 24&#39;&#39; or 48&#39;&#39; long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>granulated agar</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>90000-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held Spray Bottle</td>
			<td>Ability One</td>
			<td>24122002</td>
			<td>~0.95 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-671-55A</td>
			<td>Two chamber hemacytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab trays</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-236-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large, sealable plastic bags</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>430805</td>
			<td>38 cm x 38 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mister / watering can</td>
			<td>Bar5F</td>
			<td>B10H22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mushroom Bag Clamp</td>
			<td>Shroom Supply</td>
			<td></td>
			<td>6&#34; for small bag, 8&#34; for medium bag, 10&#34; for large bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Rye Berries</td>
			<td>Shroom Supply</td>
			<td></td>
			<td>0.5 gallon or 25 lb bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 pipette and tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Round, 100 mm diameter, 15 mm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting media</td>
			<td>Jolly Gardener</td>
			<td>Pro-Line C/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pitcher</td>
			<td>BrandTech</td>
			<td>UX0600850</td>
			<td>1 L or larger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic planting pots</td>
			<td>Neo/SCI</td>
			<td>01-1177</td>
			<td>~15 cm diameter and ~10 cm height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic, autoclave-safe bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>UX0601022</td>
			<td>3 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quarter-strength potato dextrose agar media</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX1420028</td>
			<td>Use powder in combination with recipe for QPDA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific Balance Scale, measuring in g</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>30208458</td>
			<td>Any precise scale that can hold and measure 200g will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size #4 cork bore</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>NC9585352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Mushroom grow bag</td>
			<td>Shroom Supply</td>
			<td></td>
			<td>0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil trowel</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>563876946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam flats (6 x 12 cells)</td>
			<td>Speedling</td>
			<td>Model TR72A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam flats (8 x 16 cells)</td>
			<td>Speedling</td>
			<td>Model TR128A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 or 10 mL)</td>
			<td>fisher Scientific</td>
			<td>14-829-19C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>TM-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V8 Original 100% Vegetable Juice</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>564638212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watermelon Seed - Black Diamond</td>
			<td>Willhite Seed Inc</td>
			<td>17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watermelon Seed - Calhoun Gray</td>
			<td>Holmes Seed Company</td>
			<td>4440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watermelon Seed - Charleston Gray</td>
			<td>Bonnie Plants</td>
			<td>7.15339E+11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watermelon Seed - PI 296341-FR</td>
			<td>Contact authors</td>
			<td>Contact authors</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)</td>
			<td>Alachua County Feed &#38; Seed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a contrast of three inoculation techniques used to determine the race of unknown fusarium oxysporum f.sp. niveum isolates

由尖孢镰刀菌 f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病 （Citrullus lanatus） 已重新成为美国东南部，特别是佛罗里达州的主要生产制约因素。部署综合虫害管理战略，如针对特定种族的抗性品种，需要有关种植者田间病原体的多样性和种群密度的信息。尽管在开发用于鉴定病原体分离株的分子诊断工具方面取得了一些进展，但种族确定通常需要生物测定方法。
通过根浸接种，侵扰籽粒播种法和改良的托盘浸渍法（黑钻石，查尔斯顿灰，卡尔霍恩灰，植物介绍296341-FR）中的每一种进行种族分型。通过计算接种后五周的疾病发病率，为分离株分配种族名称。如果特定品种中不到33%的植物有症状，则它们被归类为抗性植物。发生率大于33%的品种为易感品种。本文介绍了三种不同的接种方法，以确定种族，根浸，侵染的内核和改良的托盘浸渍接种，其应用因实验设计而异。

这些实验有助于确定通常生长的品种的相对抗性（表1）。然后，这些信息可用于指导基于当地Fon人口的管理建议。换句话说，如果已知种族0或1存在于商业田地中，那么农民可能倾向于种植“抗性”品种，如Calhoun Gray，Sunsugar或同等品种。使用所有方法的生物测定结果表明，当幼苗感染Race 1分离株时，黑钻石和查尔斯顿灰品种死亡或表现出严重症状，而Calhoun Grey和PI品种表现出抗性（<...

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A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates

管理西瓜枯萎病需要了解存在的病原体种族。在这里，我们描述了根浸，感染的内核播种和改良的托盘浸渍接种方法，以证明它们在致病真菌 尖孢镰刀菌 f. sp niveum （Fon）的种族分型中的功效。

用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离

Fusarium wilt of watermelon (Citrullus lanatus), caused by Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), has reemerged as a major production constraint in the ...

该协议可以帮助参与西瓜社区的人评估镰刀菌枯萎病病原体，这将有助于确定存在的病原体种群并帮助有效管理它。种族分型镰刀菌枯萎病的完成过程复杂且耗时，并且具有三种可行的种族分型生物测定选项将允许用户选择最适合其实验条件的方法。所有这三种方法都有助于植物健康从业者诊断与特定分离株相关的镰刀菌枯萎病感染的潜在严重程度。这些信息有助于做出明智而有效的综合疾病管理决策。要开始种植准备，请用种植培养基填充8x16细胞开始，同时向下敲击以压缩土壤。然后，播种，其顶点指向与长度相等的深度。播种后，用富勒的泥土覆盖含有埋藏种子的培养基至0.3175至0.635厘米的深度，然后将平整雾化以抑制培养基，而不会产生站立或积水。之后，每180分钟喷雾20秒，持续五天，直到种子发芽，保持培养基湿润。发芽后，每天浇水一次。种植后五天，将直径为1至1.25厘米的浸润纸盘（含有优选的尖孢镰刀菌分离物）放入一种澄清的V8果汁培养基和1/4强度的马铃薯葡萄糖琼脂或QPDA培养基板上，将其储存在28摄氏度的培养箱中8天。在第八天，将V8和QPDA板转移到生物安全柜中，然后通过在培养基表面上刮下无菌细胞播撒器并将液体分生孢子悬浮液池池到无菌的50毫升培养管中来移位分生孢子。接下来，通过将计算的约100万个孢子的体积转移到新鲜的无菌培养管中并用无菌去离子水使总体积达到30毫升来量化孢子计数并制备最终的接种液溶液。为了准备接种，将6x12细胞泡沫塑料平板预先用10%漂白剂消毒并冲洗干净以接受接种的植物。接种前几个小时，彻底浇灌植物。浇水两小时后，从8x16细胞泡沫塑料平板上取出试管苗并冲洗其根部。然后，将冲洗过的植物暂时存放在干净的容器中，用自来水直至使用，使品种彼此分开。之后，将幼苗分成六个个体，并将幼苗组用湿纸巾包裹在实验室托盘上。在6x12阵列聚苯乙烯泡沫托盘的每个电池的底部放置25至30立方厘米的土壤，并使用喷射瓶将土壤弄湿，直到土壤明显潮湿。从健康对照开始，将一组同一品种的未损坏的六株幼苗放入含有接种物的50毫升管中。为了接种疫苗，将根部浸没30秒的试管婴儿管涡旋。接下来，将每个细胞的单个试管苗放在6x12发泡胶平板中，将同一品种的植物放在托盘的一列中。用种植培养基覆盖试管苗，轻轻定型。使用注射器用20毫升水润湿试管苗，同时避免飞溅。当所有幼苗都重新种植后，将试苗放在平均温度为27摄氏度的封闭黑暗环境中过夜。为了侵扰果仁，通过在QPDA板上分离和培养尖孢镰刀菌菌株以使其生长覆盖板的一半来制备接种物。通过将无菌的自来水添加到装有200克内核的一升玻璃锥形瓶中来制备内核，以完全覆盖至少五厘米的谷物。将果仁在24摄氏度下浸泡在烧瓶中两小时后，从烧瓶中沥干水分，用一块用奶酪布包裹的棉卷堵住烧瓶的开口，然后用铝箔包装覆盖开口。在高压釜中以重力循环对烧瓶进行灭菌一小时，干燥时间为五分钟，然后让烧瓶冷却至室温。将谷物转移到带有过滤器的蘑菇生长袋中。从袋子中取出空气，然后将多余的塑料折叠在袋子周围。将袋子放在塑料高压灭菌器安全的垃圾箱中，并用铝箔包装覆盖垃圾箱，然后使用与以前相同的设置再次高压灭菌。高压灭菌后，让真菌在袋中的内核上孵育三周。使用四号尺寸的无菌软木孔，从培养板上的活性生长区切割直径六毫米的琼脂盘。展开袋子，用严格的无菌技术放置五个琼脂盘。使用无菌的50毫升量筒测量并向袋中加入35毫升无菌自来水。用灌封混合物填充塑料罐，然后将测量量的灌封混合物加入装有14粒受感染内核的大塑料袋中。在袋子里做一个气垫，并在混合内核和土壤之前通过多次倒置袋子将其密封。完成后，用受感染的土壤混合物填充表面灭菌的锅。对每个剩余的西瓜品种重复该过程，每个被测试的分离物总共四个完整的受感染土壤罐。接下来，在锅中播种六粒西瓜种子，种子的顶端朝上。使用喷雾瓶，用水润湿上部0.3至0.6厘米的土壤，然后在每个锅的下方和上方放置一个透明的塑料盘。以4：1：1的比例用蒸汽巴氏杀菌砂，泥炭，蛭石填充48个细胞插入物，然后向下敲击插入物以压缩土壤。然后，将插入物放入塑料托盘中，并如前所述播种。种植前七天，用浸润的纸张接种五个QPDA板，以14小时/ 10小时的黑暗周期将它们储存在培养区域八天。在第七天，将两个一平方厘米的琼脂塞子转移到每个含有100毫升马铃薯葡萄糖的250毫升锥形瓶中，并将锥形瓶放在台式摇摇杯上。在接种当天，通过四层无菌奶酪布过滤接种物来收获孢子，以确定烧瓶的微分生孢子浓度。播种14天后，将细胞插入物与幼苗一起转移到织带托盘中，然后将与幼苗一起的织带托盘放入装有七升接种悬浮液的塑料桶中。保持接种物不受干扰15分钟后，将含有接种幼苗的细胞插入物转移到无孔托盘中，并将无孔托盘放在温室工作台上，然后根据需要浇水。保持前面所述的根浸生物测定的照明和环境条件。根据所使用的方法，通过观察和计算枯萎和植物死亡的发生率来开始评级，并拍摄数字图像来记录疾病进展。在改良的托盘浸渍方法中，感染了race-2分离株的黑钻石和查尔斯顿灰品种表现出严重的症状并死亡。相比之下，Citrullus amarus PI品种表现出抗性。在根蘸法中，感染了0族分离株的幼苗大多存活下来，而几乎所有感染了第3种分离株的幼苗都死亡。在受感染的内核方法中，在种族2出没的土壤中生长的Sugar Baby和Charleston Gray品种已经开始枯萎和死亡，而Citrullus amarus PI植物仍然看起来很健康。记住要适当地播种和维持植物，检查病原体分离株的生存能力，了解每种接种方法的独特技术，并在评估疾病症状时保持一致。凭借这些方法的结果，研究人员可以通过测序和比较基因组学分析来研究控制分离株之间差异方差表达的潜在遗传决定因素。使用这些方法，研究人员已经能够评估不同位置不同毒力表型的流行情况，并将这些表型与可观察到的遗传元素进行比较。

用于确定未知尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。尼维姆分离

Abstract

用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离

Abstract

用于确定未知尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。尼维姆分离