用于确定未知 尖孢镰刀菌 f.sp的种族的三种接种技术的对比。 尼维姆 分离

Summary

管理西瓜枯萎病需要了解存在的病原体种族。在这里，我们描述了根浸，感染的内核播种和改良的托盘浸渍接种方法，以证明它们在致病真菌 尖孢镰刀菌 f. sp niveum （Fon）的种族分型中的功效。

Abstract

由尖孢镰刀菌 f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病 （Citrullus lanatus） 已重新成为美国东南部，特别是佛罗里达州的主要生产制约因素。部署综合虫害管理战略，如针对特定种族的抗性品种，需要有关种植者田间病原体的多样性和种群密度的信息。尽管在开发用于鉴定病原体分离株的分子诊断工具方面取得了一些进展，但种族确定通常需要生物测定方法。

通过根浸接种，侵扰籽粒播种法和改良的托盘浸渍法（黑钻石，查尔斯顿灰，卡尔霍恩灰，植物介绍296341-FR）中的每一种进行种族分型。通过计算接种后五周的疾病发病率，为分离株分配种族名称。如果特定品种中不到33%的植物有症状，则它们被归类为抗性植物。发生率大于33%的品种为易感品种。本文介绍了三种不同的接种方法，以确定种族，根浸，侵染的内核和改良的托盘浸渍接种，其应用因实验设计而异。

Introduction

构成 尖孢镰刀菌 物种复合物（FOSC）的土生真菌是影响性的半生物养植物病原体，可导致多种作物的严重疾病和产量损失¹。由 F. oxysporum f. sp. niveum （Fon） 引起的西瓜镰刀菌枯萎病在过去 几十年中在世界各地的范围、发病率和严重程度都在增加^2，3.在幼苗中，镰刀菌枯萎病的症状通常类似于阻尼。在较老的植物中，叶子变成灰色，绿化和坏死。最终，植物的枯萎进展为植物完全崩溃和死亡⁴。直接产量损失是由于植物的症状和死亡而发生的，而间接产量损失可能是由于太阳损害造成的，由叶面冠层⁵的消除引起的。在 F. oxysporum 中从未观察到有性繁殖和相关生殖结构。然而，病原体产生两种类型的无性孢子，微分生孢子和大分生孢子，以及称为衣原体孢子的更大的长期生存结构，可以在土壤中存活多年⁶。

FOSC根据观察到的宿主范围被分类为特殊形态，通常限于一个或几个宿主物种¹。虽然最近的研究表明，这种物种复合物可能是15种不同物种的复合物，....

Protocol

1. 通过浸根法（RDM）确定种族

1. 实验环境的准备
   1. 由于症状表达高度依赖于环境条件，因此将植物保持在受控区域。监测相对湿度、温度、光周期和光照强度（图1）。
      1. 将温度设置为26-28°C，相对湿度设置为50-75%，并设置16小时的光周期，以确保植物足够的生长和健康。
         注意：为了防止缺氧，幼苗枯萎和/或种子腐烂，不要在幼苗周围过度浇水?.......

Discussion

已经提出了三种种族分型方法。这些方法中的每一种都最适合特定的问题和实验条件。侵扰的籽粒接种方法（土壤侵扰）可能更简单，更直接，使其对于评估致病性³⁰特别有用。使用这种方法进行简单的种族分型是非常有效的。然而，应用该方法来确定特定品种的抗性可能具有挑战性，因为每种植物可能不面临相同程度的感染或暴露，并且可能需要同样高水平的疾病来测试感兴?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Fuller’s Earth	Sigma-Aldrich	F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask	PYREX	4980-1L
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
50 mL graduated cylinder	Lab Safety Supply	41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes	Fisher Scientific	05-413-921
Aluminum foil wrap	Reynolds Wrap	720
Bleach	Walmart	587192290
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-391-301
CaCO3	sigma-Aldrich	239216
cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-11
Cheesecloth	Lions Services, Inc	8305-01-125-0725
Clear plastic dishes	Visions Wave	999RP6CLSS	~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Sterile
Ethanol	Fisher Chemical	A4094	100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights	MaxLume	Model T5	2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar	VWR International	90000-786
Hand-held Spray Bottle	Ability One	24122002	~0.95 L
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-55A	Two chamber hemacytometer
Lab trays	Fisher Scientific	15-236-2A
Large, sealable plastic bags	Ziploc	430805	38 cm x 38 cm
Mister / watering can	Bar5F	B10H22
Mushroom Bag Clamp	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D
Organic Rye Berries	Shroom Supply		0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips	Fisher Scientific	14-388-100
Petri dishes	Fisherbrand	FB0875713	Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
Plastic Pitcher	BrandTech	UX0600850	1 L or larger
Plastic planting pots	Neo/SCI	01-1177	~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin	Thermo Scientific	UX0601022	3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media	Cole-Parmer	UX1420028	Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g	Ohaus	30208458	Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore	Cole-Parmer	NC9585352
Small Mushroom grow bag	Shroom Supply		0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel	Walmart	563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells)	Speedling	Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells)	Speedling	Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL)	fisher Scientific	14-829-19C
Timer	Walmart	TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice	Walmart	564638212
vortex	Fisher Scientific	02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond	Willhite Seed Inc	17
Watermelon Seed - Calhoun Gray	Holmes Seed Company	4440
Watermelon Seed - Charleston Gray	Bonnie Plants	7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR	Contact authors	Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)	Alachua County Feed & Seed