المجهر الفلوري ثلاثي الفوتون للأنسجة العميقة في دماغ الفأر وسمك الزرد السليم

تعد تقنيات الفحص المجهري متعدد الفوتونات ، مثل المجهر ثنائي الفوتون (2PM) والمجهر ثلاثي الفوتونات (3PM) ، أدوات قوية للتصوير العميق للأنسجة في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. 3PM له ميزتان رئيسيتان لتصوير الأنسجة العميقة على مدار 2 مساء والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختبرات الأحياء: (i) طول التوهين الأطول في الأنسجة المبعثرة عن طريق استخدام ~ 1,300 نانومتر أو ~ 1,700 نانومتر ليزر الإثارة. (ii) توليد تألق أقل في الخلفية بسبب الإثارة غير الخطية ذات الترتيب الأعلى. ونتيجة لذلك ، يسمح 3PM بالتصوير الهيكلي والوظيفي عالي التباين في عمق الأنسجة المتناثرة مثل دماغ الفأر السليم من الطبقات القشرية إلى الحصين والدماغ الأمامي بأكمله لأسماك الزرد البالغة.

اليوم ، تتوفر مصادر الليزر المناسبة ل 3PM تجاريا ، مما يتيح تحويل نظام تصوير حالي ثنائي الفوتون (2P) إلى نظام ثلاثي الفوتون (3P). بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر العديد من المجاهر التجارية 3P ، مما يجعل هذه التقنية متاحة بسهولة لمختبرات أبحاث علم الأحياء. تظهر هذه الورقة تحسين إعداد 3PM النموذجي ، خاصة استهداف مجموعات البيولوجيا التي لديها بالفعل إعداد 2P ، وتوضح التصوير ثلاثي الأبعاد داخل الحيوية في أدمغة الفئران وأسماك الزرد البالغة السليمة. يغطي هذا البروتوكول الإجراء التجريبي الكامل للتصوير ثلاثي الأبعاد ، بما في ذلك محاذاة المجهر ، والنقيق المسبق لنبضات الليزر ~ 1,300 و ~ 1,700 نانومتر ، وإعداد الحيوانات ، والتصوير الفلوري 3P داخل الحيوية في عمق أزهار الزرد والفئران البالغة.