完整小鼠和斑马鱼大脑的深组织三光子荧光显微镜

多光子显微镜技术，如双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM），是具有亚细胞分辨率的深部组织 体内 成像的强大工具。3PM对于在生物学实验室中广泛使用的2PM以上的深部组织成像具有两个主要优点：（i）通过采用~1，300 nm或~1，700 nm激发激光，在散射组织中具有更长的衰减长度;（ii）由于高阶非线性激发而产生的背景荧光较少。因此，3PM允许在散射组织（例如从皮质层到海马体和成年斑马鱼的整个前脑的完整小鼠大脑）的深处进行高对比度的结构和功能成像。

如今，适用于3PM的激光源已经上市，可以将现有的双光子（2P）成像系统转换为三光子（3P）系统。此外，还有多种商用3P显微镜可用，这使得该技术随时可供生物学研究实验室使用。本文展示了典型3PM设置的优化，特别是针对已经具有2P设置的生物学组，并展示了完整小鼠和成年斑马鱼大脑的活体3D成像。该协议涵盖了3P成像的完整实验过程，包括显微镜对准，〜1，300和〜1，700nm激光脉冲的预切，动物制备以及成年斑马鱼和小鼠大脑深处的活体3P荧光成像。