Dybvævsmikroskopi af tre-fotonfluorescens i intakt muse- og zebrafiskhjerne

Multifotonmikroskopiteknikker, såsom to-fotonmikroskopi (2PM) og tre-fotonmikroskopi (3PM), er kraftfulde værktøjer til dybvæv in vivo-billeddannelse med subcellulær opløsning. 3PM har to store fordele ved dybvævsbilleddannelse over kl. 14.00, der har været meget udbredt i biologiske laboratorier: (i) længere dæmpningslængde i spredningsvæv ved at anvende ~ 1.300 nm eller ~ 1.700 nm excitationslaser; ii) mindre baggrundsfluorescensgenerering på grund af højere ordens ikke-lineær excitation. Som et resultat tillader 3PM strukturel og funktionel billeddannelse med høj kontrast dybt inde i spredningsvæv såsom intakt musehjerne fra de kortikale lag til hippocampus og hele forhjernen af voksne zebrafisk.

I dag er laserkilder, der er egnede til kl. 15.00, kommercielt tilgængelige, hvilket muliggør konvertering af et eksisterende to-foton (2P) billeddannelsessystem til et tre-foton (3P) system. Derudover er flere kommercielle 3P-mikroskoper tilgængelige, hvilket gør denne teknik let tilgængelig for biologiske forskningslaboratorier. Dette papir viser optimeringen af en typisk 3PM-opsætning, især rettet mod biologiske grupper, der allerede har en 2P-opsætning, og demonstrerer intravital 3D-billeddannelse i intakte muse- og voksne zebrafiskhjerner. Denne protokol dækker den fulde eksperimentelle procedure for 3P-billeddannelse, herunder mikroskopjustering, prechirping af ~ 1.300 og ~ 1.700 nm laserimpulser, dyrepræparation og intravital 3P fluorescensbilleddannelse dybt i voksne zebrafisk og musehjerner.