Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multifotonenmicroscopietechnieken, zoals tweefotonenmicroscopie (2PM) en drie-fotonenmicroscopie (3PM), zijn krachtige hulpmiddelen voor deep-tissue in vivo beeldvorming met subcellulaire resolutie. 3PM heeft twee grote voordelen voor deep-tissue beeldvorming over 2PM die op grote schaal is gebruikt in biologielaboratoria: (i) langere dempingslengte in verstrooiende weefsels door gebruik te maken van ~ 1.300 nm of ~ 1.700 nm excitatielaser; ii) minder achtergrondfluorescentiegeneratie als gevolg van niet-lineaire excitatie van hogere orde. Als gevolg hiervan maakt 3PM structurele en functionele beeldvorming met hoog contrast diep in verstrooiende weefsels mogelijk, zoals intact muizenbrein van de corticale lagen naar de hippocampus en de volledige voorhersenen van volwassen zebravissen.

Tegenwoordig zijn laserbronnen die geschikt zijn voor 3PM commercieel beschikbaar, waardoor een bestaand twee-foton (2P) beeldvormingssysteem kan worden omgezet in een drie-foton (3P) systeem. Bovendien zijn er meerdere commerciële 3P-microscopen beschikbaar, waardoor deze techniek gemakkelijk beschikbaar is voor biologische onderzoekslaboratoria. Dit artikel toont de optimalisatie van een typische 3PM-opstelling, met name gericht op biologiegroepen die al een 2P-opstelling hebben, en demonstreert intravitale 3D-beeldvorming in intacte muizen- en volwassen zebravishersenen. Dit protocol omvat de volledige experimentele procedure van 3P-beeldvorming, inclusief microscoopuitlijning, prechirping van ~ 1.300 en ~ 1.700 nm laserpulsen, diervoorbereiding en intravitale 3P-fluorescentiebeeldvorming diep in volwassen zebravis- en muizenhersenen.