Microscopie à fluorescence à trois photons des tissus profonds dans le cerveau intact d’une souris et d’un poisson-zèbre

Les techniques de microscopie multiphotonique, telles que la microscopie à deux photons (2PM) et la microscopie à trois photons (3PM), sont des outils puissants pour l’imagerie in vivo des tissus profonds avec une résolution subcellulaire. 3PM présente deux avantages majeurs pour l’imagerie des tissus profonds par rapport à 2PM qui a été largement utilisée dans les laboratoires de biologie: (i) une longueur d’atténuation plus longue dans les tissus diffusants en utilisant un laser d’excitation ~ 1 300 nm ou ~ 1 700 nm; (ii) moins de génération de fluorescence de fond en raison d’une excitation non linéaire d’ordre supérieur. En conséquence, 3PM permet une imagerie structurelle et fonctionnelle à contraste élevé profondément dans les tissus de diffusion tels que le cerveau intact de la souris des couches corticales à l’hippocampe et à l’ensemble du cerveau antérieur du poisson-zèbre adulte.

Aujourd’hui, des sources laser adaptées à 3PM sont disponibles dans le commerce, permettant la conversion d’un système d’imagerie à deux photons (2P) existant en un système à trois photons (3P). De plus, plusieurs microscopes 3P commerciaux sont disponibles, ce qui rend cette technique facilement accessible aux laboratoires de recherche en biologie. Cet article montre l’optimisation d’une configuration typique de 15 heures, ciblant en particulier les groupes de biologie qui ont déjà une configuration 2P, et démontre l’imagerie 3D intravitale dans des cerveaux intacts de souris et de poissons-zèbres adultes. Ce protocole couvre la procédure expérimentale complète de l’imagerie 3P, y compris l’alignement au microscope, le prépuce d’impulsions laser ~1 300 et ~1 700 nm, la préparation animale et l’imagerie de fluorescence 3P intravitale au plus profond du cerveau des poissons-zèbres et des souris adultes.