Tiefengewebs-Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in intaktem Maus- und Zebrafischgehirn

Multiphotonenmikroskopie-Techniken wie die Zwei-Photonen-Mikroskopie (2PM) und die Drei-Photonen-Mikroskopie (3PM) sind leistungsstarke Werkzeuge für die Tiefengewebe-In-vivo-Bildgebung mit subzellulärer Auflösung. 3PM hat zwei Hauptvorteile für die Tiefengewebebildgebung gegenüber 2PM, die in Biologielabors weit verbreitet ist: (i) längere Dämpfungslänge in streuendem Gewebe durch den Einsatz von ~ 1.300 nm oder ~ 1.700 nm Anregungslaser; (ii) geringere Hintergrundfluoreszenzerzeugung aufgrund einer nichtlinearen Anregung höherer Ordnung. Infolgedessen ermöglicht 3PM eine kontrastreiche strukturelle und funktionelle Bildgebung tief in streuendem Gewebe wie dem intakten Mausgehirn von den kortikalen Schichten bis zum Hippocampus und dem gesamten Vorderhirn erwachsener Zebrafische.

Heute sind Laserquellen, die für 3PM geeignet sind, kommerziell erhältlich, was die Umwandlung eines bestehenden Zwei-Photonen-Bildgebungssystems (2P) in ein Drei-Photonen-System (3P) ermöglicht. Darüber hinaus sind mehrere kommerzielle 3P-Mikroskope erhältlich, wodurch diese Technik für biologische Forschungslaboratorien leicht zugänglich ist. Dieses Papier zeigt die Optimierung eines typischen 3PM-Setups, insbesondere für Biologiegruppen, die bereits ein 2P-Setup haben, und demonstriert intravitale 3D-Bildgebung in intakten Maus- und erwachsenen Zebrafischgehirnen. Dieses Protokoll deckt das gesamte experimentelle Verfahren der 3P-Bildgebung ab, einschließlich Mikroskopausrichtung, Vorzwitschern von ~ 1.300 und ~ 1.700 nm Laserpulsen, Tierpräparation und intravitaler 3P-Fluoreszenzbildgebung tief in erwachsenen Zebrafisch- und Mäusegehirnen.