מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תלת-פוטונית של שלושה פוטונים ברקמות עמוקות במוח של עכברים ושל דגי זברה שלמים

טכניקות מיקרוסקופיית מולטי-פוטון, כגון מיקרוסקופיית שני פוטונים (14:00) ומיקרוסקופיית שלושה פוטונים (15:00), הן כלים רבי עוצמה להדמיית in vivo של רקמות עמוקות ברזולוציה תת-תאית. לשעה 15:00 יש שני יתרונות עיקריים להדמיית רקמות עמוקות במהלך 14:00 שנמצאת בשימוש נרחב במעבדות ביולוגיה: (i) אורך הנחתה ארוך יותר ברקמות פיזור על ידי שימוש בלייזר עירור של כ-1,300 ננומטר או ~1,700 ננומטר; (ii) פחות יצירת פלואורסצנציה ברקע עקב עירור לא ליניארי מסדר גבוה יותר. כתוצאה מכך, השעה 15:00 מאפשרת הדמיה מבנית ותפקודית בעלת ניגודיות גבוהה בעומק רקמות מתפזרות כגון מוח עכבר שלם משכבות קליפת המוח ועד להיפוקמפוס וכל המוח הקדמי של דגי זברה בוגרים.

כיום, מקורות לייזר המתאימים לשעה 15:00 זמינים באופן מסחרי, ומאפשרים המרה של מערכת הדמיה קיימת של שני פוטונים (2P) למערכת תלת-פוטונים (3P). בנוסף, קיימים מספר מיקרוסקופים מסחריים של 3P, מה שהופך את הטכניקה הזו לזמינה למעבדות מחקר ביולוגיות. מאמר זה מראה את האופטימיזציה של הגדרה טיפוסית של 15:00, במיוחד התמקדות בקבוצות ביולוגיה שכבר יש להן הגדרת 2P, ומדגים הדמיה תלת-ממדית תוך-ורידית במוחות של עכברים ושל דגי זברה בוגרים שלמים. פרוטוקול זה מכסה את ההליך הניסיוני המלא של הדמיית 3P, כולל יישור מיקרוסקופ, בדיקה מוקדמת של כ-1,300 ו-1,700 ננומטר פולסים של לייזר, הכנת בעלי חיים והדמיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של 3P עמוק במוחות של דגי זברה ועכברים בוגרים.