Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

Le tecniche di microscopia multifotonica, come la microscopia a due fotoni (2PM) e la microscopia a tre fotoni (3PM), sono potenti strumenti per l'imaging in vivo dei tessuti profondi con risoluzione subcellulare. 3PM ha due principali vantaggi per l'imaging dei tessuti profondi rispetto alle 2PM che è stato ampiamente utilizzato nei laboratori di biologia: (i) lunghezza di attenuazione più lunga nei tessuti a dispersione impiegando ~ 1.300 nm o ~ 1.700 nm laser di eccitazione; (ii) minore generazione di fluorescenza di fondo a causa dell'eccitazione non lineare di ordine superiore. Di conseguenza, 3PM consente l'imaging strutturale e funzionale ad alto contrasto in profondità all'interno di tessuti sparsi come il cervello di topo intatto dagli strati corticali all'ippocampo e l'intero proencefalo del pesce zebra adulto.

Oggi, le sorgenti laser adatte per le 3PM sono disponibili in commercio, consentendo la conversione di un sistema di imaging a due fotoni (2P) esistente in un sistema a tre fotoni (3P). Inoltre, sono disponibili più microscopi 3P commerciali, il che rende questa tecnica prontamente disponibile per i laboratori di ricerca biologica. Questo documento mostra l'ottimizzazione di una tipica configurazione 3PM, in particolare rivolta ai gruppi di biologia che hanno già una configurazione 2P, e dimostra l'imaging 3D intravitale in cervelli di topi e pesci zebra adulti intatti. Questo protocollo copre l'intera procedura sperimentale di imaging 3P, incluso l'allineamento al microscopio, il prechirping di impulsi laser ~ 1.300 e ~ 1.700 nm, la preparazione animale e l'imaging intravitale a fluorescenza 3P in profondità nel cervello adulto di zebrafish e topo.