Dypvev tre-foton fluorescens mikroskopi i intakt mus og sebrafisk hjerne

Multifotonmikroskopiteknikker, for eksempel tofotonmikroskopi (14:00) og trefotonmikroskopi (15:00), er kraftige verktøy for dypvevs in vivo-avbildning med subcellulær oppløsning. 15:00 har to store fordeler for dypvevsavbildning over 14:00 som har blitt mye brukt i biologilaboratorier: (i) lengre dempingslengde i spredningsvev ved å bruke ~ 1300 nm eller ~ 1700 nm eksitasjonslaser; (ii) mindre bakgrunnsfluorescensgenerering på grunn av høyere ordens ikke-lineær eksitasjon. Som et resultat tillater 15:00 strukturell og funksjonell avbildning med høy kontrast dypt inne i spredningsvev som intakt musehjerne fra kortikale lag til hippocampus og hele forebrain av voksen sebrafisk.

I dag er laserkilder som er egnet for 15:00 kommersielt tilgjengelige, noe som muliggjør konvertering av et eksisterende to-foton (2P) bildebehandlingssystem til et tre-foton (3P) system. I tillegg er flere kommersielle 3P-mikroskoper tilgjengelige, noe som gjør denne teknikken lett tilgjengelig for biologiforskningslaboratorier. Dette dokumentet viser optimaliseringen av et typisk 3PM-oppsett, spesielt rettet mot biologigrupper som allerede har et 2P-oppsett, og demonstrerer intravital 3D-avbildning i intakt mus og voksne sebrafiskhjerner. Denne protokollen dekker den fullstendige eksperimentelle prosedyren for 3P-avbildning, inkludert mikroskopjustering, prechirping av ~ 1300 og ~ 1700 nm laserpulser, dyreforberedelse og intravital 3P fluorescensavbildning dypt i voksne sebrafisk og musehjerner.