Microscopia de fluorescência de três fótons profundos em rato intacto e cérebro de zebrafish

As técnicas de microscopia multifotúr, como microscopia de dois fótons (2PM) e microscopia de três fótons (3PM), são ferramentas poderosas para imagens in vivo de tecido profundo com resolução subcelular. 3PM tem duas grandes vantagens para a imagem de tecido profundo acima de 2PM que tem sido amplamente utilizado em laboratórios de biologia: (i) maior comprimento de atenuação em tecidos de dispersão, empregando ~1.300 nm ou ~1.700 nm laser de excitação; (ii) menor geração de fluorescência de fundo devido à excitação não linear de alta ordem. Como resultado, o 3PM permite imagens estruturais e funcionais de alto contraste profundamente dentro de tecidos de dispersão, como cérebro de rato intacto das camadas corticais para o hipocampo e todo o cérebro de zebrafish adulto.

Hoje, fontes de laser adequadas para 3PM estão disponíveis comercialmente, permitindo a conversão de um sistema de imagem de dois fótons (2P) existente para um sistema de três fótons (3P). Além disso, vários microscópios comerciais 3P estão disponíveis, o que torna essa técnica prontamente disponível para laboratórios de pesquisa em biologia. Este artigo mostra a otimização de uma configuração típica de 3PM, particularmente visando grupos de biologia que já possuem uma configuração 2P, e demonstra imagens 3D intravital em cérebros de camundongos intactos e zebrafish adultos. Este protocolo abrange o procedimento experimental completo de imagens 3P, incluindo alinhamento de microscópio, pré-chir de ~1.300 e ~1.700 nm de pulsos laser, preparação animal e imagens de fluorescência intravital 3P profundas em zebrafish adultos e cérebros de camundongos.