Глубокотканная трехфотонная флуоресцентная микроскопия в интактном мозге мышей и рыбок данио

Методы многофотонной микроскопии, такие как двухфотонная микроскопия (2PM) и трехфотонная микроскопия (3PM), являются мощными инструментами для глубокой визуализации тканей in vivo с субклеточным разрешением. 3PM имеет два основных преимущества для глубокой визуализации тканей в течение 2PM, которые широко используются в биологических лабораториях: (i) более длинная длина затухания в рассеивающих тканях за счет использования ~ 1 300 нм или ~ 1 700 нм лазера возбуждения; (ii) меньшая фоновая флуоресценция за счет нелинейного возбуждения более высокого порядка. В результате 3PM позволяет создавать высококонтрастную структурную и функциональную визуализацию глубоко внутри рассеивающих тканей, таких как неповрежденный мозг мыши от кортикальных слоев до гиппокампа и всего переднего мозга взрослых рыбок данио.

Сегодня лазерные источники, подходящие для 3PM, коммерчески доступны, что позволяет преобразовать существующую двухфотонную (2P) систему визуализации в трехфотонную (3P) систему. Кроме того, доступно несколько коммерческих микроскопов 3P, что делает этот метод легко доступным для биологических исследовательских лабораторий. В этой статье показана оптимизация типичной установки 3PM, особенно ориентированной на биологические группы, которые уже имеют настройку 2P, и демонстрируется прижизненная 3D-визуализация в интактном мозге мышей и взрослых рыбок данио. Этот протокол охватывает полную экспериментальную процедуру визуализации 3P, включая выравнивание микроскопом, предварительное щипцирование ~ 1 300 и ~ 1 700 нм лазерных импульсов, подготовку животных и прижизненную флуоресцентную визуализацию 3P глубоко в мозге взрослых рыбок данио и мышей.