Microscopía de fluorescencia de tres fotones de tejido profundo en cerebro intacto de ratón y pez cebra

Las técnicas de microscopía multifotónica, como la microscopía de dos fotones (2PM) y la microscopía de tres fotones (3PM), son herramientas poderosas para la obtención de imágenes in vivo de tejidos profundos con resolución subcelular. 3PM tiene dos ventajas principales para las imágenes de tejidos profundos sobre 2PM que se han utilizado ampliamente en los laboratorios de biología: (i) una mayor longitud de atenuación en los tejidos de dispersión mediante el empleo de ~ 1,300 nm o ~ 1,700 nm de láser de excitación; (ii) menos generación de fluorescencia de fondo debido a la excitación no lineal de orden superior. Como resultado, 3PM permite imágenes estructurales y funcionales de alto contraste en lo profundo de los tejidos dispersos, como el cerebro intacto del ratón desde las capas corticales hasta el hipocampo y todo el cerebro anterior del pez cebra adulto.

Hoy en día, las fuentes láser adecuadas para 3PM están disponibles comercialmente, lo que permite la conversión de un sistema de imágenes de dos fotones (2P) existente en un sistema de tres fotones (3P). Además, hay disponibles múltiples microscopios 3P comerciales, lo que hace que esta técnica esté fácilmente disponible para los laboratorios de investigación biológica. Este artículo muestra la optimización de una configuración típica de 3PM, particularmente dirigida a grupos de biología que ya tienen una configuración 2P, y demuestra imágenes 3D intravitales en cerebros intactos de ratones y peces cebra adultos. Este protocolo cubre el procedimiento experimental completo de imágenes 3P, incluida la alineación del microscopio, el prepicado de pulsos láser de ~ 1,300 y ~ 1,700 nm, la preparación animal y las imágenes de fluorescencia 3P intravital en profundidades en cerebros adultos de pez cebra y ratón.