Djupvävnad trefotonfluorescensmikroskopi i intakt mus- och zebrafiskhjärna

Multifotonmikroskopitekniker, såsom tvåfotonmikroskopi (2PM) och trefotonmikroskopi (3PM), är kraftfulla verktyg för djupvävnadsin vivo-avbildning med subcellulär upplösning. 3PM har två stora fördelar för djupvävnadsavbildning över 2PM som har använts i stor utsträckning i biologiska laboratorier: (i) längre dämpningslängd i spridningsvävnader genom att använda ~ 1,300 nm eller ~ 1,700 nm excitationslaser; ii) mindre generering av bakgrundsfluorescens på grund av olinjär excitation av högre ordning. Som ett resultat tillåter 3PM strukturell och funktionell avbildning med hög kontrast djupt inne i spridningsvävnader som intakt mushjärna från de kortikala skikten till hippocampus och hela framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.

Idag är laserkällor lämpliga för 3PM kommersiellt tillgängliga, vilket möjliggör omvandling av ett befintligt tvåfoton (2P) bildsystem till ett trefotonsystem (3P). Dessutom finns flera kommersiella 3P-mikroskop tillgängliga, vilket gör denna teknik lätt tillgänglig för biologiska forskningslaboratorier. Detta dokument visar optimeringen av en typisk 3PM-inställning, särskilt inriktad på biologigrupper som redan har en 2P-inställning, och visar intravital 3D-avbildning i intakta mus- och vuxna zebrafiskhjärnor. Detta protokoll täcker det fullständiga experimentella förfarandet för 3P-avbildning, inklusive mikroskopinriktning, prechirping av ~ 1,300 och ~ 1,700 nm laserpulser, djurberedning och intravital 3P fluorescensavbildning djupt i vuxna zebrafisk- och mushjärnor.