로라 이소벨 맥콜 박사, 버로우스 웰컴 기금에서 감염증 의 병기 상에 있는 조사관을 개최합니다. 저자는 NIH 어워드 번호 R21AI148886, NIH 상 번호 P20GM103648에 따라 오클라호마 호흡기 감염증 센터 (OCRID)의 파일럿 교부금, 오클라호마 대학에서 시작 기금 (LIM)의 지원을 인정하고자합니다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 또한이 프로토콜에 사용되는 도구의 개발자에게 감사를 표하고자합니다. 모든 관련 출판물이 인용되었습니다.

보고할 이해 상충이 없습니다.

trypanosomatid 감염을 이해하는 것은 새로운 약 발달 및 처리 접근을 지도하기 위하여 필수적입니다. 이 화학 지도 제작 방법은 신진 대사와 trypanosomatid 질병 병증 사이의 관계에 대한 실행 가능한 통찰력을 제공하기 위해 독특하게 태세를 갖추고 있으므로이 번역적 필요성을 해결합니다.
메타볼라이트 추출 및 MS 분석 중에 LCD-MS 등급 용매만 권장하여 백그라운드 오염을 줄입니다. 일반적으로 파라핀 필름 및/또는 기타 플라스틱36,37,38에서 파생되는 중합체 오염35는 가능한 경우 피해야 합니다. 특히 파라필름은 절대로 사용해서는 안 됩니다. LC-MS 데이터 품질은 샘플 준비 및 대사 산물 추출 중에 사용되는 재료에 따라 달라지므로 이러한 측면은 매우 중요합니다. 'ili 플롯을 생성하기 전에 데이터 품질을 보장해야 합니다. 또한 이러한 포괄적인 공간 메타볼로믹스 맵을 생성하려면 이러한 맵의 간격을 피하기 위해 수집된 모든 샘플에서 인접한 모든 조직 샘플과 대사산물 추출을 수집해야 합니다. 따라서 수집 절차, 대사 산물 추출 및 LC-MS 분석의 물류, 따라서 비용을 고려하고 그에 따라 계획해야합니다.
이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 사용자 요구를 충족하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 대사산물 추출 중에 사용되는 용매의 극성 및 용해도는 대사산물이 검출되는 것에 영향을 미칩니다39. 표적 화학 지도 제작 분석을 위해 검출된 대사산물 기능의 다양성을 극대화하려면 여러 추출 단계와 용매를 결합하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 이 방법은 비극성 및 극성 분자20,40의 정확한 검출을 가능하게 하기 때문에 디클로로메탄, 메탄올 및 물을 추출 용매로 활용합니다. 그러나 이러한 용매는 모든 MS 실험에 보편적으로 적합하지 않으며 연구원은 프로젝트의 목표에 따라 추출 용매를 선택해야 합니다. 마찬가지로, 역상 크로마토그래피를 정상 위상 크로마토그래피로 대체하는 등 다양한 LC-MS/MS 조건을 사용할 수 있습니다. 대체 컬럼은 C8 크로마토그래피 대신 반전 위상 데이터 수집에 사용할 수 있지만 경험적으로 C8 크로마토그래피는 조직 지질에 더 견고하며 막힘 주파수가 낮습니다. 개념적으로, 이러한 프로토콜은 가스 크로마토그래피 질량 분광법 등과 같은 다른 질량 분석 방법에도 적용될 수 있다.
다른 접근법은 질량 분석 이미징입니다. 실제로, 질량 분광화상 화상 진찰 접근과는 달리, 액체 크로마토그래피 질량 분광법은 본질적으로 공간 정보를 보존하지 않습니다10. 화학 지도 제작은 프로젝트 개념화 시, 샘플 메타데이터 및 데이터 처리 단계에서 샘플링 위치를 포함시켜 이러한 격차를 해소합니다. 질량 분석 영상과는 달리 이 화학 적 지도 제작 접근법의 강도는 대부분의 응용 프로그램이 주석에 만 정확한 질량에 의존하는 대량 분광 화상 진찰과는 달리 자신감 있는 주석(Metabolomics 표준 이니셔티브 레벨 1 또는 레벨 2 주석 신뢰41)을 제공하는 기능입니다. 질량 분석 이미징은 미세한 공간 매핑을 가능하게 할 것이며, 때로는 단일 세포 수준(예: 42,43)까지 내려갈 수 있습니다. 대조적으로, 화학지도학 접근은 고도로 전문화한 전동물 저온 절제 기술을 요구하지 않고 대사 산물 분포의 대규모 교차 기관 매핑을 가능하게 합니다. 화학 지도 제작은 개발중인 많은 공간 전사 적 접근법에 대한 보완적 증거를 제공합니다, 예를 들어,44, 표현형에 가장 가까운 'omics 층'에 초점을 맞추고의 장점과 함께 45. 기생충 부하 정량화를 위한 대체 방법은 견본 수집6의 시간에 생물 발광을 측정하는 포함합니다6. 미세 세그먼트는 또한 국소적인 기생충 부담 및 조직 손상을 평가하기 위하여 공초점 또는 전자 현미경 검사를 가능하게 하기 위하여 집합될 수 있었습니다. 이 프로토콜및 이전 간행물13에서 사이토카인 정량화에 사용되는 물 균질은 조직 손상의 단백질 기반 마커를 정량화하는 데 사용될 수도 있습니다.
또한 생성된 LC-MS 데이터를 플롯하는 데 적합한 3D 모델을 얻는 방법에도 여러 가지가 있습니다. 여기에 제안 된 방법 외에도 다양한 온라인 공급 업체에서 모델을 미리 구입할 수 있습니다. 사용 약관이 특히 게시와 관련된 의도된 사용과 일치하는지 확인합니다. 스캐너 지침에 따라 3D 스캐너를 사용하여 대형 장기용 모델을 생성할 수 있습니다. MATLAB과 같은 대안은 화학 지도 제작을 위한 3D 모델을 생성하고 시각화하기 위한 존재이지만, 주로 'ili16' 개발 전에 구현되었다. MATLAB은 다양한 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공하는 데이터 분석 및 프로그래밍 도구 제품군입니다. 그러나 MATLAB은 무료도 오픈 소스도 아니며, 특히 MATLAB이 대량 분광법 데이터를 처리하기 위해 개발되지 않았다는 점을 고려할 때 MATLAB 인터페이스에 익숙해야합니다. 이 제안된 방법의 대안, 즉 SketchUp, Meshlab 및 'ili는 자유롭게 접근 가능하고 사용자 친화적이며 화학 지도 제작 목적으로 MATLAB과 유사한 기능을 제공합니다.
이 방법은 샘플 준비 및 대사 산물 추출에 관한 강력한 방법입니다. 문제 해결은 LC-MS 데이터 수집 단계에서 가장 자주 필요합니다. 이는 이 문서의 범위를 벗어납니다. 독자는 LC-MS 데이터 수집 문제 해결에 대한 우수한 출판물로 이동되며 20,47을 포함합니다. 마찬가지로 대사산물 음장의 복잡성은 이 메서드가 3D 모델 생성에 초점을 맞추는 범위를 벗어납니다. 이 항목에 대한 유용한 참조는 24,25,48,49를 포함합니다.
이 방법은 효과적으로 질병 병인을 탐구하는 동안, 어떤 metabolomics 실험에 걸쳐 일반적인 몇몇이 접근에 한계가 있습니다. 이러한 제한 사항 중 하나는 LC-MS 기능의 낮은 주석 비율입니다50, 이는 참조 스펙트럼 라이브러리의 가용성과 품질에 따라 다름. 추가 제한은 이 프로토콜이 LC-MS/MS 분석을 가진 RNAlater와 같은 RNA 보존 시약의 비호환성때문에 mRNA를 보존하지 않는다는 것입니다. 그러나, 단백질 품질은 다운스트림 분석에 적합하므로 mRNA 기반 분석을 대체할 수 있다.
감염 병인에 대한 화학 지도 제작 접근법은 세균성, 바이러스성 또는 기생 감염이 기관 시스템에서 어떻게 발전하고 국소화된 질병을 일으키는지 직접적으로 반영합니다. 이러한 지역 하위 샘플을 분석하고 3D 모델을 생성하는 것은 궁극적으로 대사산물이 3차원 공간에서 작동하는 방법을 전달하여 이전에는 인식되지 않았던 분자 생물학 의 공간 차원에 빛을 발산합니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 대사산물 국소화는 트리파노소마 크루시 기생충 부하와 비교되었다. 결과는 병원체와 호스트 조직 사이 관계를 명확히 하고 또한 Chagas 질병 현상 진행의 신진 대사 역학을 보여주었습니다6. 화학지도 제작 방법은 인간 내장 환경 상호 작용51,52,53, 인간 피부46 및 폐와 같은 장기 시스템의 화학 적 구성, 식물 대사 및 환경 상호 작용555와 같은 다양한 주제에도 적용되었습니다. 향후 응용 프로그램은 지역화된 질병 내성 및 탄력성을 평가하거나, 현지 대사산물 수준, 병원체 트로피즘 및 질병 트로피주의 사이의 관계를 trypanosomatid 감염 을 넘어 모델에서 평가포함될 수 있습니다. 이 접근법은 또한 현재 약동성 프로토콜을 확장하는 광범위한 적용성을 가져야하며, 지역 조직 약물 수준과 약물 대사 와 전반적인 대사 문맥, 조직 손상 및 병원균 클리어런스 사이의 관계를 평가해야합니다. 전반적으로 화학 지도 제작은 질병 병인, 인간 건강, 인간 환경 상호 작용 및 미생물 역학을 포함한 응용 프로그램과 함께 다양한 샘플 유형의 대사 산물 분포를 독특한 탐색 할 수 있습니다.

Trypanosomatid 기생충은 리슈마니아 종, 아프리카 trypanosomes (Trypanosoma brucei), 그리고 미국 trypanosomes (Trypanosoma cruzi)로 구성됩니다. 리슈마니아 원생동물은 자기 치유와 자기 제한된 국소 된 키산 염 리슈만 전각증, 점막 조직이 손상되는 점막 류만증, 내장 열대 성구와 내장 성비증을 가진 내장 성모를 일으키는 데 2, 그는 21, 그는 내장 및 그는 열을 일으키는 원인이 되는 내장 성 모성 마비를 일으키는 원인이 됩니다. T. 브루시 원인 인간 아프리카 trypanosomiasis (HAT), 또한 수 면 질병으로 알려진, 주로 아프리카 국가에서 보고 3. 임상 징후와 증상은 기생충이 혈류와 림프계로 국소화 될 때 간질, 발열, 두통, 근골격계 통증, 림프절 단계의 빈혈을 포함한다. 이것은 기생충이 중앙 신경계에 국소화하고 수면 장애, 행동 변경 및 결국 치명적인 comas4를 일으키는 원인이 되는 meningo-뇌찰 단계 뒤에 선행됩니다. T. 크루즈는 미대륙에서 샤가스 질병, 풍토병을 일으킵니다. 감염된 개별은 넓은 기생충 트로피와 함께 초기 급성 단계를 경험합니다, 일반적으로 무증상. 감염된 개별의 대략 10%-30%는 메가오식하게, megacolon 및 심장 혈관 합병증에 의해 특징지어지는 감염의 수십 년 후에 만성 단계 현상을 경험합니다5,6.
Metabolomics는 1 차또는 이차 물질 대사및 약물 또는 식품 유래 분자와 같은 외부 유래 화합물에서 생물학적 화합물을 포함하여 작은 분자 종 (50-1,500 Da)을 연구합니다. 숙주 병원체 상호 작용의 맥락에서, metabolomics는 호스트 대사 산물 환경에 감염의 충격을 탐구할 수 있습니다, 호스트에 병원체의 효력에 접근하는 데 결정적인. 또한 숙주 영양 및 면역 환경7,8,9에 병원균 적응을 평가할 수 있습니다. 질량 분광법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 대사 산물을 식별, 정량화 및 특성화하는 데 사용되는 일반적인 메타볼로믹스 도구입니다. 이 "omics" 접근은 또한 바이오마커 발견 및 약물 개발에 적용될 수 있습니다10,11.
trypanosomatid 기생충의 특정 조직 트로피즘을 감안할 때, 공간 metabolomics 분석은 그(것)들이 일으키는 원인이 되는 질병의 병인에 중요한 통찰력을 가능하게 할 수 있습니다. 대사 산물의 공간 분포를 매핑하면 마우스 심장 조직에서 만성 Trypanosoma cruzi 감염에 의해 로컬로 영향을 받는 대사 산물과 마우스 위장관내 급성 및 장기 Trypanosoma cruzi 감염6,12,13. 특히, 3D 화학 지도 제작은 만성 Trypanosoma cruzi 감염 마우스의 심장 조직에 있는 기생충 지속성 및 신진 대사 변경 사이 단절을 보여주었습니다. 신진 대사는 Chagas 질병 증상 (심장 apical 동맥류)의 사이트와 일치, 심장의 낮은 및 apical 세그먼트에서 가장 혼란했다. 특정 심장 부위의 감염에 의해 침을 흘리며 질병 심각도와 상관 관계가 있는 대사산물 가족은 아실카르니틴과 글리페로포스포콜린12,13,14를 포함한다. 위장관에서는 Chagas 질병 증상의 사이트와 일치 하는 지속적인 신진 대사 변경: 식 도와 결 장. 대조적으로, 신진 대사는 소장과 같은 Chagas 질병 현상과 연관되지 않는 사이트에서 재정규화됩니다. 위장관에서 감염에 의해 국소적으로 방해되는 대사산물은 아실카르니틴, 글리세로포스포콜린, 키누레닌, 트립토판 및 담수산을 포함한다. 또한, 이러한 분석은 Chagas 질병에 내성의 새로운 대사 메커니즘의 식별을 가능하게6. 피부 성 구종증의 연구에 이러한 방법을 적용하면 병변 부위의 중요한 대사 성변이 밝혀졌지만 병변 인접, 거시적으로 건강한 조직의 특정 대사 변화도 밝혀졌습니다. 예를 들어, 글루타민은 병변 부위에서 고갈된 반면, m/z(질량 대 전하 비율)의 글리세로포스포콜린은 200-299, 400-499, 500-599 및 600-699가 병변 부위에서 현저히 증가하였다. PC(O-34:1)는 병변 인접 부위15에서만 증가하였다.
본 원고의 목표는 트리파노소마티드 기생충 감염 모델에 적용된 대사산물 분포("화학지도제작")의 3D 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 시연하는 것이다(도 1). 이 접근 방식은 메타볼로믹스 및 메타볼로믹스 데이터 처리, 특히 메타볼로믹스 데이터를 3D 모델에 쉽게 플롯하는 'ili 소프트웨어'의 개발의 맥락에서 몇 가지 중요한 발전을 기반으로 합니다16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L bottle, pyrex</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L graduated cylinder, pyrex</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL SafeLock Eppendorf tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20901-540</td>
			<td>use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>as appropriate for system under investigation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm stainless steel bead</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3252449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195&#8211;200 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analytical balance</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195&#8211;200 (2007).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biosafety cabinet</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>class II, type A2; any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG 
			ACCCC primer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53&#8211;59 (2003).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemiluminescent-capable imaging system</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any system, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton balls</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryogloves</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97008-208</td>
			<td>replace with any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dry ice</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>extra-length forceps</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flammable-grade refrigerator</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezer storage boxes for microcentrifuge tubes</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fume hood</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high-resolution mass spectrometer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ili software</td>
			<td>ili.embl.de</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large tupperware</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Optima</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade dicholoromethane</td>
			<td>Fisher Optima</td>
			<td>D151-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade formic acid</td>
			<td>Fisher Optima</td>
			<td>A11750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade methanol</td>
			<td>Fisher Optima</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS grade water</td>
			<td>Fisher Optima</td>
			<td>W64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatography column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4499-AN</td>
			<td>may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatography column guard cartridge</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>AJ0-8784</td>
			<td>may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid chromatography column guard cartridge holder</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>AJ0-9000</td>
			<td>may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshLab software</td>
			<td>https://www.meshlab.net/</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meshmixer software</td>
			<td>https://www.meshmixer.com/</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS calibrant</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>appropriate one for available instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS data processing software</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>multiple options available; authors recommend MZmine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSConvert software</td>
			<td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>other nanodrop models are also suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipet tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>use the appropriate brand to fit available pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipettor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>use the appropriate brand to fit available pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p20 pipettor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette tips</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>use the appropriate brand to fit available pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipettor</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)</td>
			<td>Quansys biosciences</td>
			<td>110949MS</td>
			<td>can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps)</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>D4069</td>
			<td>replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>real-time thermocycler</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>salt shaker or tea infuser</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SketchUp software</td>
			<td>https://www.sketchup.com/</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>specimen forceps</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet software</td>
			<td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td>
			<td>NA</td>
			<td>can replace with other spreadsheet management software, as applicable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfachloropyridazine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9882-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfadimethoxine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7007-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sybr green qPCR reaction mix</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A25780</td>
			<td>can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT 
			GGCCCA primer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53&#8211;59 (2003).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue homogenizer</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue samples</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>from appropriate infection model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser single-bead dispenser</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UHPLC</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-low temperature freezer (-80)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic bath</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any system, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wet ice</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>any brand, as available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zone-free sealing film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;490007-390</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical cartography approaches to study trypanosomatid infection

병원균 트로피즘과 질병 트로피즘은 병원체에 의해 선택적으로 식민지화되거나 손상된 조직 위치를 말하며, 국소질환 증상으로 이어진다. 인간 감염 trypanosomatid 기생충 은 Trypanosoma cruzi, Chagas 질병의 원인 에이전트를 포함합니다; 트리파노종 브루시, 수면 장애의 원인 에이전트; 그리고 리슈마니아 종, 리슈마니아의 원인 에이전트. 공동으로 전 세계 2천만 명에게 영향을 미칩니다. 이 기생충은 특정 열대성 을 보여줍니다 : 심장, 식도, T. cruzi 에 대한 결장, 지방 조직, 췌장, 피부, 순환 시스템 및 T. 브루시 에 대한 중추 신경계, 피부 성 류 매니아 균주를위한 피부, 간, 비장 및 내장 성 Leishmania 균주를위한 골수. 공간 적 관점은 그러므로 trypanosomatid 질병 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 화학 지도 제작은 미생물 및 면역 학적 매개 변수에 비해 액체 크로마토그래피 질량 분광법을 통해 생성 된 작은 분자 풍부의 3D 시각화를 생성합니다. 이 프로토콜은 체계적인 조직 샘플링 및 대사산물 추출에서 시작하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 데이터 수집을 시작으로 대사 산물 분포의 3D 맵 생성으로 마무리하는 데 화학 적 지도 제작이 trypanosomatid 감염 중에 병원성 과정을 연구하는 데 어떻게 적용 될 수 있는지 보여줍니다. 이 방법은 T. cruzi, T. brucei, 또는 Leishmania 에 의한 조직 식민지화를 위한 영양소 요구 사항, 감염 부위의 면역대사, 그리고 국소 조직 대사 성 교란 및 임상 질환 증상 사이의 관계와 같은 다중 연구 질문에 사용될 수 있으며, 이는 trypanosomatid 질환 병기증에 대한 포괄적인 통찰력으로 이어진다.

얻어진 대사산물 피처의 수는 분석된 조직 유형 및 데이터 처리 파라미터에 따라 달라집니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 T. cruzi 감염의 마우스 모델에서 위장관 메타볼로메에 대한 T. 크루지 감염의 공간적 영향을 분석하는 데 사용되었습니다. 이전 작업에서, 남성 C3H/HeJ는 1,000 CL + luc T. cruzi 기생충32,6로 회중적으로 주입되었다. 동물은 감염 후 12일 또는 89일 동안 안락사되었고, 위장관의 13개의 연속세그먼트에 대한 화학지도제작분석이 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이 분석을 통해 5,502개의 피쳐 테이블이 이 프로토콜에 설명된 단계를 사용하여 3D로 시각화되었습니다. 이 접근법은 높은 기생충 부하 (kynurenine, 그림 2B 대 기생충 부하, 그림 2A)의 사이트에서 높은 개별 동물에서 대사 산물 특징의 시각화를 가능하게합니다, 조직 영역 (글루타민, 그림 2C) 및 대사 산물 특징은 작고 큰 내장에 걸쳐 유사한 수준에서 발견되는 대사 산물 기능 (LPE: 16 그림)에 걸쳐 유사한 수준에서 발견된다 (LPE 26 그림 ). Kynurenine는 T. cruzi load33를 조절하는 kynurenine 유래 대사 산물의 능력에 염증 및 이전 간행물과의 알려진 관계 때문에 시각화를 위해 선택되었습니다. 무작위 산림 기반 기계 학습 모델은 이전에 kynurenine 수준과 감염 상태 6 사이의 연관성을 공개했다. 글루타민은 체외 글루타민 가용성과 T. 크루지 약물 감도 34 사이의 관계를 보여주는 이전 간행물을 기반으로 시각화를 위해 선택되었다. 차등 분포는 물류 회귀, p < 0.05를 사용하여 확인되었다. LPE 16:0은 조직의 사이트 전체에서 유사한 수준에서 발견되는 대사 산물 특징을 발견하기 위해 데이터를 육안으로 검사한 후 선택되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> 그림 1: 프로토콜 개요입니다. 그림은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> 그림 2: 화학 지도 제작 분석. 남성 C3H/HeJ 마우스는 1,000 CL+luc T. cruzi 기생충으로 회대적으로 주입되었다. 동물은 감염 후 12일 또는 89일 동안 안락사되었고, 위장관을 체계적으로 채취하여 단면하였다(1단계)6. 대사 산물은 2단계에서와 같이 추출되었고 LC-MS/MS에 의해 분석되었으며.3D 모델 생성은 SketchUp 소프트웨어(Step 5)를 이용하여 수행되었고, 6단계에서와 같이 데이터가 3D로 플롯되었다. (A) 특정 마우스에서 기생충 분포, 12 일 감염 후. (B) 같은 마우스에서 키누레닌 대사 산물 분포, 12 일 감염 후. (C) 감염된 마우스에 걸쳐 글루타민 분포를 의미, 89 감염 후 일. (D) m /z 454.292 의 비교 수준 2.929 분, 2 헥사데카노일-sn-글리세로-3-인포에탄올라민(LPE 16:0),소장 및 대장에서 A및 B와 동일한 마우스로 음부한다. 샘플및 데이터는 6에서 생성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

이 프로토콜은 샘플 수집, 대사 산물 추출, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 데이터 수집, 3D 모델 생성 및 마지막으로 데이터 시각화를 포함하여 trypanosomatid 감염 시 대사 산물 분포의 3D 모델을 생성하는 단계를 설명합니다.

화학 지도 제작 은 Trypanosomatid 감염을 연구 하는 접근

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

이 프로토콜은 대사 산물 및 기생충 분포의 3D 모델을 구축하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 국소 조직 대사 교란, 기생충 분포 및 임상 질환 증상 사이의 관계를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 대사 산물 분포 대 병원체 분포 및 통계 분석의 라이브 스케일 교차 장기 매핑을 가능하게한다는 것입니다.이론적으로 화학 지도 제작은 병인과 치료 효과를 담당하는 대사 산물을 직접 검사하여 숙주에 대한 질병의 발달과 영향을 탐구 할 수 있습니다. 튜브를 칭량하고 라벨을 붙이는 것으로 시작하십시오. 조직을 튜브 당 하나의 섹션으로 체계적으로 단면화하십시오.조직 샘플이 들어있는 튜브의 무게를 측정하여 샘플 무게를 결정하고 무게를 기록하십시오. 조직 샘플의 수성 균질화를 수행하려면 조직 샘플을 포함하는 두 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 하나의 다섯 밀리미터 스테인레스 스틸 비드를 추가하십시오. LCMS 등급의 물이 들어있는 빈 튜브 하나를 만드십시오.냉각된 LCMS 등급 물을 첨가하여 시료 50밀리그램당 500마이크로리터의 부피를 구성한 다음, 샘플을 25헤르츠에서 3분 동안 균질화합니다. 샘플은 철저히 균질화되어야합니다. DNA 추출 및 기타 분석을 위해 균질화 부피의 1/10을 수집합니다.네 마이크로몰의 설파클로로피리다진으로 스파이크된 얼음 차가운 LCMS 등급 메탄올을 균질액에 첨가한다. 샘플을 조직 균질기에서 3분 동안 25 헤르츠에서 균질화하고, 이어서 10분 동안 원심분리한다. 같은 부피의 상청액을 96 웰 플레이트에 모으고 상청액을 수집하는 동안 얼음 위에 단단한 잔류 물을 보관하십시오.수성 추출 상청액을 최대 속도와 가열 없이 사용하여 완전히 건조시킨다. 고체 잔류 물 샘플 50 밀리그램 당 두 개의 마이크로몰 설파클로로피리다진으로 스파이크된 미리 냉각된 디클로로메탄 메탄올 1,000 마이크로리터를 첨가하여 유기 추출을 수행한다. 샘플을 5분 동안 25헤르츠에서 균질화하고, 10분 동안 원심분리하였다.같은 양의 상청액을 96 웰 플레이트에 넣으십시오. 관심있는 기관의 사진을 찍으십시오. 파일을 클릭 한 다음 SketchUp 소프트웨어에서 가져 오기를 클릭하여 관심있는 기관의 그림을 가져옵니다.선 도구를 클릭하고 자유형 옵션을 선택하십시오. 연필 도구를 사용하여 관심있는 기관의 윤곽선을 추적하고 그립니다. 밀어넣기/당기기 도구를 선택하고 음영처리된 영역을 위로 당겨 드로잉을 2D에서 3D로 변환합니다.파일 내보내기를 클릭한 다음 3D 모델을 클릭하여 dae 형식으로 파일을 내보냅니다. 모델의 사실성을 향상시키려면 파일을 선택한 다음 메쉬 가져오기를 클릭하여 모델을 MeshLab 소프트웨어로 가져옵니다. 상단 메뉴에서 와이어프레임을 선택한 다음, 필터를 선택하고 리메시 단순화 및 재구성을 클릭한 다음, 세분할 서피스 중간점을 클릭합니다.모든 값을 기본값으로 두고 적용을 두 번 선택합니다. 파일을 클릭한 다음 메쉬를 다른 이름으로 내보내기를 클릭한 다음 형식 드롭다운 메뉴의 파일에서 SDL 파일 형식을 선택하여 모델을 sdl 형식으로 내보냅니다. 이것을 저장하고 다음 팝업 메뉴에서 확인을 선택하십시오.Meshmixer 소프트웨어를 열고 이전 단계에서 생성된 sdl 파일을 가져옵니다. 조각, 브러시, 드래곤 조각, 브러시, 팽창 도구를 사용하여 반올림해야하는 모델 표면을 꺼냅니다. 모델이 원하는 모양을 갖게되면 파일 및 내보내기를 클릭하여 sdl 형식으로 저장하십시오.원하는 대로 파일 이름을 지정하고 SDL 바이너리 형식을 선택한 후 저장합니다. MeshLab 소프트웨어에서 3D 모델을 엽니다. 포스트 오픈 처리 팝업 창에서 확인을 클릭하십시오.선택점 도구를 선택하여 각 샘플링 스폿에 대한 X, Y 및 Z 좌표를 가져온 다음 3D 모델 서피스에서 정기적으로 간격을 두고 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 원하는 좌표가 모두 선택되면 양식 팝업 창에서 맨 위에 있는 저장 단추를 클릭합니다. 스프레드 시트 소프트웨어에서 이전 단계에서 생성 된 pp 파일을 엽니 다.데이터 텍스트를 열로 클릭한 다음 구분을 클릭하여 데이터 표시를 조정합니다. 다음을 클릭 한 다음 공간을 선택하고 마침을 클릭하십시오. 홈 찾기 및 바꾸기 선택을 선택하여 스프레드시트 셀에 숫자 값만 남도록 서식을 다시 지정합니다.찾을 상자에 Y 등수 코트를 입력하고 바꾸기 상자를 비워 둡니다. 모두 바꾸기를 클릭 한 다음 확인을 클릭하십시오. X 동일한 코트와 Z 동일한 코트 및 보다 큰 코트 슬래시에 대해 반복하십시오. 스프레드시트 소프트웨어 테이블에서 행은 각 위치에 해당하고 열은 데이터에 해당합니다.적절한 메타데이터와 풍부한 대사산물 특징을 후속 스프레드시트 열에 붙여 넣습니다. 반지름 열에 모델에서 시각화할 샘플링 스폿의 원하는 크기를 입력합니다. 반경의 값을 경험적으로 결정하고 파일을 CSV 형식으로 저장합니다.ELI 플롯 소프트웨어로 이동하여 서피스(Surface)를 선택한 다음, 생성된 3D 모델을 브라우저 창으로 끌어다 놓습니다. 생성된 피쳐 테이블을 동일한 브라우저 창으로 끌어다 놓습니다. 오른쪽 아래 모서리에 있는 범례를 사용하여 3D 모델에 원하는 데이터 열을 투영합니다.각 데이터 열을 연속적으로 선택하여 3D 모델에서 이 대사산물 피쳐의 분포를 평가합니다. 이 분석을 통해 5, 502 개의 피처와 3D로 시각화 된 테이블이 탄생했습니다. 이 접근법은 높은 기생충 부하의 부위에서 높은 개별 동물의 대사 산물 특징, 조직 영역에 걸쳐 차별적 인 분포를 가진 대사 산물 및 소장과 대장에서 비슷한 수준에서 발견되는 대사 산물 특징을 시각화 할 수있게합니다.LCMS 용매 만 사용하고 모든 인접한 조직을 수집하고 공간지도의 틈새를 피하기 위해 수집 된 모든 샘플에 대한 대사 산물을 추출하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 Trypanosomatid 기생충에 의한 조직 식민지화에 대한 영양 요구 사항을 탐구하여 감염시 3D 대사 산물 분포도를 비교하여 질병 병인을 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

화학 지도 제작 은 Trypanosomatid 감염을 연구 하는 접근

Abstract