Finansieringskilder omfatter Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) og Texas A & M University. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

1. Cellebelægning til billeddannelse
<ol><li>Aspirer mediet fra en 80-90% sammenflydende T-75-kolbe mcF-7-celler, skyl cellerne med 10 ml sterilt fosfatbufret saltvand (PBS), og tilsæt 2 ml 0,25% trypsin (1x) for at løsne cellerne fra kolbebunden.</li>
	<li>Kolben inkuberes ved 37 °C i ~4 min. Kontroller cellerne under mikroskopet for at bekræfte løsrivelse.</li>
	<li>Tilsæt straks 8 ml kulturmedium for at deaktivere trypsinen.</li>
	<li>Saml cellerne i et konisk rør (15 ml eller 50 ml). Tæl c...

Autofluorescensintensitet og levetidsbilleddannelse er blevet brugt i vid udstrækning til at vurdere metabolisme i celler21,55. FLIM er høj opløsning og løser derfor enkeltceller, hvilket er vigtigt for kræftundersøgelser, fordi cellulær heterogenitet bidrager til tumoraggression og lægemiddelresistens7,39,41,44,45,46,58.</...

Metabolisme er den cellulære proces til produktion af energi. Cellulær metabolisme omfatter flere veje, herunder glykolyse, oxidativ fosforylering og glutaminolyse. Sunde celler bruger disse metaboliske veje til at generere energi til spredning og funktion, såsom produktion af cytokiner af immunceller. Mange sygdomme, herunder stofskifteforstyrrelser, kræft og neurodegeneration, er karakteriseret ved ændret cellulær metabolisme1. For eksempel har nogle kræftcelletyper forhøjede glykolysehastigheder, selv i nærvær af ilt, for at generere molekyler til syntese af nukleinsyrer, proteiner og lipider2,3. Dette fænomen, kendt som Warburg-effekten, er et kendetegn for mange kræfttyper, herunder brystkræft, lungekræft og glioblastomer4. På grund af ændringerne i cellulær metabolisme forbundet med kræftprogression kan cellulær metabolisme være en surrogatbiomarkør for lægemiddelrespons5,6. Desuden er forståelse af lægemiddeleffektivitet på celleniveau afgørende, da celleheterogenitet kan føre til forskellige lægemiddelresponser hos individer7,8.
Teknologier, der identificerer og kvantificerer ændringer i cellulær metabolisme, er afgørende for undersøgelser af kræft og lægemiddelrespons. Kemiske og proteinanalyser bruges til at evaluere metabolismen af celler eller væv, men mangler enkeltcelleopløsning og rumlig information. Metaboliske pladelæserbaserede assays kan måle pH og iltforbrug i prøven over tid og den efterfølgende metaboliske forstyrrelse af kemikalier. pH kan bruges til at beregne den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR), som giver et indblik i cellernes glykolytiske aktivitet9. Helkropsbilleddannelsesmetoder, herunder 2-[fluor-18] fluor-D-glucose positronemissionstomografi (FDG PET) og magnetisk resonansspektroskopi (MRS), er ikke-invasive billeddannelsesmetoder, der anvendes klinisk til at identificere tumorgentagelse og lægemiddeleffektivitet gennem metaboliske målinger10,11,12,13,14.
FDG-PET billeder vævsoptagelsen af FDG, en radioaktivt mærket glukoseanalog. Øget optagelse af FDG-PET af tumorer i forhold til omgivende væv skyldes Warburg-effekten12,13. MRS-billeder af almindelige kerner af molekyler, der anvendes til metabolisme, såsom 13C og 31P, og kan få dynamisk information om, hvordan stofskiftet ændres som reaktion på stimuli, såsom motion eller spisning14. Selvom FDG-PET og MRS kan bruges klinisk, mangler disse teknologier den rumlige opløsning til at løse intratumoral heterogenitet. Ligeledes foretages iltforbrugsmålinger på en bulkpopulation af celler. Autofluorescensbilleddannelse overvinder den rumlige opløsningshindring for disse teknologier og giver en ikke-invasiv metode til kvantificering af cellulær metabolisme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> Figur 1: NADH og FAD i fælles metaboliske veje. NADH og FAD er coenzymer, der anvendes i glykolyse, Krebs-cyklussen og elektrontransportkæden. Autofluorescensbilleddannelse af disse molekyler giver information om cellulær metabolisme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner, herunder glycolyse, oxidativ phosphorylering og glutaminolyse (figur 1). Både NAD(P)H og FAD er autofluorescerende og giver endogen kontrast til fluorescensbilleddannelse1,15. NADPH har lignende fluorescerende egenskaber som NADH. På grund af dette bruges NAD (P) H ofte til at repræsentere det kombinerede signal fra NADH og NADPH2,16.
Fluorescens levetidsbilleddannelse (FLIM) kvantificerer fluorescensens levetid eller den tid, hvor en fluorofor er i ophidset tilstand. Fluorescensens levetid reagerer på fluoroforernes mikromiljø og giver information om cellulær metabolisme17. NAD(P)H og FAD kan eksistere i celler i enten proteinbundne eller frie konformationer, som hver især har en anden levetid. Fri NAD(P)H har en kortere levetid end proteinbundet NAD(P)H; Omvendt har fri FAD en længere levetid end bundet FAD18,19. Levetiden og levetidskomponentvægtene kan kvantificeres ud fra fluorescensens levetidshenfaldsdata gennem Eq. (1)20:
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
Eq (1) repræsenterer den normaliserede fluorescensintensitet som funktion af tiden. De α 1 og α 2 i denne ligning repræsenterer de proportionale komponenter i korte og lange levetider (α 1+ α 2=1), henholdsvis τ1 og τ2 repræsenterer henholdsvis den korte og lange levetid, og C tegner sig for baggrundslys7,20. Den amplitudevægtede levetid, her repræsenteret som τm, beregnes ved hjælp af Eq. (2).
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
En gennemsnitlig levetid kan beregnes ved at beregne gennemsnittet af "t" over fluoroforens intensitetshenfald, som for et to-eksponentielt henfald er vist ved Eq. (3)17,21.
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
Et fluorescensintensitetsbillede kan beregnes ud fra livstidsbilledet ved at integrere fluorescensens levetidshenfald. Autofluorescensbilleddannelse er en ikke-destruktiv og etiketfri metode, der kan bruges til at karakterisere metabolismen af levende celler ved en subcellulær opløsning. Det optiske redoxforhold tilvejebringer en optisk analog metrik af cellens kemiske redoxtilstand og beregnes som forholdet mellem NAD (P) H og FAD intensiteter. Selvom formlen til beregning af det optiske redoxforhold ikke er standardiseret22,23,24,25, defineres den her som intensiteten af FAD over de kombinerede intensiteter af NAD (P) H og FAD. Denne definition anvendes, fordi den opsummerede intensitet i nævneren normaliserer metrikken mellem 0 og 1, og det forventede resultat af cyanidhæmningen er et fald i redoxforholdet. Fluorescensleveterne for fri NAD(P)H og FAD giver indsigt i ændringer i det metaboliske opløsningsmiddelmikromiljø, herunder pH, temperatur, nærhed til ilt og osmolaritet17.
Ændringer i fluorescenslevetid for de bundne fraktioner af NAD(P)H og FAD kan indikere udnyttelse af metabolisk vej og substratspecifik metabolisme26. Komponentvægte kan fortolkes for ændringer i den frie til den bundne brøkdel af coenzymerne18,19. Alt i alt tillader disse kvantitative autofluorescenslevetidsmålinger analyse af cellulær metabolisme, og autofluorescensbilleddannelse er blevet anvendt til at identificere neoplasmer fra normalt væv27,28, karakterisere stamceller29,30, evaluere immuncellefunktion31,32,33,34,35, måle neurologisk aktivitet36, 37,38 og forståelse af lægemiddeleffektivitet i kræfttyper som brystkræft og hoved- og halskræft21,39,40,41,42. Autofluorescensbilleddannelse i høj opløsning kan kombineres med billedsegmentering til enkeltcelleanalyse og kvantificering af intrapopulationsheterogenitet43,44,45,46,47.
NAD(P)H og FAD kan afbildes på enkeltfoton- eller multifotonfluorescensmikroskoper, der er konfigureret til intensitets- eller levetidsbilleddannelse. For enkeltfotonmikroskoper er NAD(P)H og FAD typisk spændte ved bølgelængder på henholdsvis 375-405 nm og 488 nm på grund af almindelige laserkilder ved disse bølgelængder48. I to-fotonfluorescens excitation vil NAD (P) H og FAD ophidse ved bølgelængder på henholdsvis ca. 700 til 750 nm og 700 til 900 nm15,49. Når fluoroforerne er spændte, udsender NAD (P) H og FAD fotoner ved bølgelængder mellem ~ 410 nm til ~ 490 nm og ~ 510 nm til ~ 640 nm, henholdsvis15. NAD(P)H- og FAD maxima-emissionsbølgelængderne er henholdsvis ca. 450 nm og 535 nm48.
På grund af deres forskellige excitations- og emissionsbølgelængder kan fluorescensen af de to metaboliske coenzymer isoleres spektralt. En forståelse af de spektrale egenskaber ved NAD (P) H og FAD er nødvendig for design og optimering af autofluorescensbilleddannelsesprotokoller. Cyanid er en elektrontransportkæde (ETC) kompleks IV-hæmmer. Virkningerne af cyanid på cellulær metabolisme og autofluorescensintensiteterne og levetiderne for NAD (P) H og FAD i celler er godt karakteriseret27,40. Derfor er et cyanidforstyrrelseseksperiment et effektivt middel til validering af NAD (P) H- og FAD-billeddannelsesprotokoller. Et vellykket cyanideeksperiment giver tillid til, at NAD (P) H og FAD-billeddannelsesprotokollen kan bruges til at vurdere metabolismen af ukendte grupper eller forstyrrelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-deoxy-d-glucose (2-DG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimicrobial (pen-strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Samples</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>N/A</td>
			<td>MCF-7 cancer line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellProfiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-664</td>
			<td>15 mL conical tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF495-Di03-25x36</td>
			<td>495 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-550/88-25</td>
			<td>550/88 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAD excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-458/64-25</td>
			<td>458/64 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Lifetime Microscope</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiphoton Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td>2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF409-Di03-25x36</td>
			<td>409 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H emission filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF02-447/60-25</td>
			<td>447/60 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD(P)H excitation filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-357/44-25</td>
			<td>357/44 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBooks 6</td>
			<td>3i</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPCImage</td>
			<td>Becker &#38; Hickl GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Fluorescence lifetime analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>okoLab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YG beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19096-2</td>
			<td>Yg microspheres (20.0 &#181;m)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism

Cellulær metabolisme er den proces, hvormed celler genererer energi, og mange sygdomme, herunder kræft, er karakteriseret ved unormal metabolisme. Reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD) er coenzymer af metaboliske reaktioner. NAD (P) H og FAD udviser autofluorescens og kan spektralt isoleres ved excitation og emissionsbølgelængder. Begge coenzymer, NAD (P) H og FAD, kan eksistere i enten en fri eller proteinbundet konfiguration, som hver især har en særskilt fluorescenslevetid - den tid, hvor fluoroforen forbliver i ophidset tilstand. Fluorescenslevetidsbilleddannelse (FLIM) muliggør kvantificering af fluorescensintensiteten og levetiden for NAD (P) H og FAD til etiketfri analyse af cellulær metabolisme. Fluorescensintensitet og levetidsmikroskoper kan optimeres til billeddannelse af NAD (P) H og FAD ved at vælge de passende excitations- og emissionsbølgelængder. Metaboliske forstyrrelser af cyanid verificerer autofluorescensbilleddannelsesprotokoller for at detektere metaboliske ændringer i celler. Denne artikel vil demonstrere teknikken til autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD til måling af cellulær metabolisme.

Epitelets brystkræftcellelinjen, MCF-7, blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Til fluorescensbilleddannelse blev cellerne podet med en densitet på 4 × 105 celler pr. 35 mm glasbundsbilleddannelsesskål 48 timer før billeddannelse. Cellerne blev afbildet før og efter cyanidbehandling ved hjælp af ovennævnte protokoller. Målet med cyanideeksperimentet er at bekræfte spektralisolering af NAD (P) H og FAD fluorescens og validere billeddannelsessysteme...

Watch this Scientific Journal Video about Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism at JoVE.com

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

Denne protokol beskriver fluorescensbilleddannelse og analyse af de endogene metaboliske coenzymer, reduceret nicotinamid adenin (phosphat) dinukleotid (NAD (P) H) og oxideret flavin adenin dinukleotid (FAD). Autofluorescensbilleddannelse af NAD (P) H og FAD giver en etiketfri, ikke-destruktiv metode til vurdering af cellulær metabolisme.

Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af cellulær metabolisme

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADH og FAD er endogene molekyler, der udviser autofluorescens ved forskellige excitations- og emissionsbølgelængder. På grund af deres anvendelse som co-enzymer af metaboliske reaktioner kan autofluorescensmikroskopi vurdere cellulær metabolisme. Autofluorescensbilleddannelse af NADH og FAD kræver ikke eksogene etiketter og er en ikke-destruktiv metode med subcellulær opløsning.Autofluorescensmikroskopi kan bruges på levende prøver og til tidskursusstudier. Autofluorescerende billeddannelse kan anvendes bredt på alle levende celler eller væv. Autofluorescerende billeddannelse er blevet anvendt på neuron, kræftcelle, tumor, in vivo, stamcelle og immunceller.Linghao Hu, en kandidatstuderende fra Quantitative Optical Imaging Laboratory ved Texas A & M University, demonstrerer proceduren. Start eksperimentet ved at tænde for alle komponenterne i multifotonfluorescensmikroskopet, herunder laserkilden og detektorerne. Før prøveplacering skal du tænde den lyse feltlampe og sikre, at lyset går ind i okularet.Vælg derefter et mål for cellebilleddannelsen. Hvis du ikke bruger et luftmål, skal du anvende en dråbe af det relevante nedsænkningsmedium oven på målet. Anbring glassbundsfadet på prøveholderen på mikroskoptrinnet.Centrer derefter prøven med målet ved hjælp af X / Y-trinkontrollen Sørg for, at prøven er sikret og ikke bevæger sig under billeddannelsen. Når det er gjort, skal du kigge ind i okularet og flytte målet op for at fokusere på cellerne. Hvis mikroskopet er inden for et kabinet, skal du lukke lysboksdøren.Åbn derefter billedoptagelsessoftwaren, og klik på fanen Multi-photon Imaging for at indstille parametrene for multifotonbilleddannelse som beskrevet i manuskriptet. Juster detektorens forstærkning til den optimale værdi for fluorescensens levetidsbilleddannelse eller FILM. Skift derefter opholdstiden for laserforbruget ved hver pixel i prøven til den ønskede værdi.For nicotinamid adeninphosphat dinukleotid, eller NADPH, sæt multi-foton laser til 750 nanometer. Bekræft derefter, at laserens strømstyring er indstillet til nul, så cellerne ikke beskadiges, når lukkeren på laseren åbnes. Indstil et emissionsfilter til 400 til 500 nanometer.Når parametrene er indstillet, skal du begynde at afbilde på en fokuserende eller live-view måde for at optimere billedindstillingerne. Øg langsomt lasereffekten fra tre til otte milliwatt, samtidig med at det sikres, at cellerne er i fokus. Når den er justeret, skal du registrere den maksimale anvendte effekt.Brug den optagede maksimale effektindstilling til billeddannelsen på andre segmenter af petriskålen. Saml et NADPH-FILM-billede med en billedintegrationstid på 60 sekunder, og kontroller, at billedet har et tilstrækkeligt antal fotoner, såsom en top på 100 fotoner til en cytoplasmapixel inden for fluorescensens levetidshenfaldskurve. Hvis antallet af fotoner er for lavt, skal du øge lasereffekten eller varigheden af billedoptagelsen.For flavin adenin dinukleotid, eller FAD, billeddannelse, indstil multi-foton laser til 890 nanometer og vent på, at laseren tilstandslås ved den nye bølgelængde. Sørg for, at laserens strømstyring oprindeligt er indstillet til nul. Indstil et emissionsfilter til 500 til 600 nanometer.For at optimere billedindstillingerne skal du begynde at billed billed på en fokuserende eller live-view måde ved at øge lasereffekten til 5 til 10 milliwatt og registrere den maksimale effekt, der bruges. Brug den samme effektindstilling til FAD-billeddannelse af efterfølgende synsfelter. Saml FAD-FILM-billedet med en billedintegrationstid på 60 sekunder, og kontroller, at billedet har tilstrækkelige fotoner inden for fluorescensens levetidshenfaldskurve.Hvis antallet af fotoner er for lavt, skal du øge lasereffekten eller varigheden af billedoptagelsen og gentage billeddannelsen i yderligere fire til fem synsfelter eller FOV'er med hvert billede placeret på to FOV'er væk. For at fremstille en 80 millimolær natriumcyanidopløsning opløses 130,24 mg natriumcyanid i 25 ml PBS. Fra kulturskålen aspirerer 100 mikroliter kulturmedium til erstatning med 100 mikroliter natriumcyanidopløsning for at opnå en fire millimolær koncentration af cyanid i skålen.Sæt cellerne i en inkubator i fem minutter for at give cellerne mulighed for at reagere med cyanidopløsningen. Efter cyanideksponeringen erhverves NADPH- og FAD-billeder af cellerne som beskrevet tidligere. Undersøgelsen beregnede fluorescensens levetidsparametre ved hjælp af den målte instrumentresponsfunktion eller IRF fra urinstof.Parametrene blev gennemsnitligt på tværs af pixels af cytoplasmaet i hver celle, der blev anvendt til segmentering. Individuelle celler blev identificeret og maskeret for at eliminere baggrundsstøj. Derefter blev kernen identificeret og projiceret på cellemasken.Endvidere blev cellerne filtreret for at fjerne de maskerede områder, der ikke passer til størrelsen af typiske celler. Multi-fotonfluorescensens levetidsbilleddannelse af NADPH og FAD tillod visualisering af cellemorfologi og metabolisme før og efter cyanidbehandling. Det blev observeret, at NADPH's levetid falder med cyanidbehandling, mens FAD's levetid øges efter cyanidbehandling.Det repræsentative boksplot viste, at det optiske redoxforhold mellem MCF7-celler faldt efter cyanidbehandling. Cyanideksponeringen reducerede den amplitudevægtede NADPH-levetid for MCF7-celler. De korte og lange levetider faldt for NADPH, men steg for NADPH alpha one.For FAD steg MCF7-cellernes amplitudevægtede levetid efter cyanideksponering. Både den korte og lange levetid steg for FAD, men faldt for FAD alpha one. Det er vigtigt at have nok laserkraft til prøverne, men husk, at for meget strøm kan forårsage skade på cellerne.Fordi autofluorescensbilleddannelse ikke er skadelig for cellerne, kan efterfølgende biokemiske assays anvendes på de samme prøver.

Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af cellulær metabolisme

Abstract